铁核桃芦丁合成相关基因的克隆及表达分析

发布时间：2020-09-12 09:10

　　核桃为胡桃科(Juglandaceae)核桃属(Juglans)植物,原产我国的栽培种主要有核桃(J.regia)和铁核桃(J.sigillata)2个种群。核桃坚果品质优良,与榛子、扁桃、腰果并称为世界四大干果,核桃作为一种营养密集型保健食品,含有丰富的多不饱和脂肪酸、蛋白质和次级代谢产物,如多酚类物质、生物碱、维生素等,具有抗氧化性、抗菌等一系列药理功能。课题组前期研究表明芦丁是铁核桃膜质种皮和叶片中含量最高的单体酚,与铁核桃总酚、总黄酮含量及抗氧化能力均呈极显著正相关关系,其含量的高低对铁核桃中总酚含量有重要的影响;利用分子生物学手段揭示核桃功能成分的合成与调控机理已成为研究热点。本实验以铁核桃‘黔核7号’叶片为材料,克隆了10个芦丁合成相关基因,测定了不同组织间及叶片、果实发育过程中总酚、总黄酮及芦丁的含量,分析了相关酶活性以及基因表达水平,探讨了酶活、基因表达与总酚、总黄酮及芦丁含量间的关系,为研究铁核桃芦丁合成机制提供了更多信息,本研究获得的主要结果如下:(1)以铁核桃‘黔核7号’展叶期叶片cDNA为模板获得了芦丁生物合成途径中的PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、F3H、F3’H、FLS、UGT及GT基因的全长cDNA序列,利用NCBI的Blastp工具进行比对分析显示,10个结构基因与其它已知植物的相关基因均具有较高的同源性。运用生物信息学分析软件对其蛋白分子量、理论等电点、不稳定指数、信号肽、磷酸化位点、糖基化位点、跨膜结构域、二级结构及保守结构域等进行了分析,并提交到NCBI的基因库中,获得的GenBank登录号分别为PAL(MG727558)、C4H(MG727559)、4CL(MG736731)、CHS(MG736732)、CHI(MG736733)、F3H(MG736734)、F3’H(MG736735)、FLS(MG736736)、UGT(MG736737)、GT(MG736738)。(2)对5个常用的植物内参基因GAPDH、β-Actin、18S rRNA、UBQ和EF-1在核桃(Juglans spp.)中进行了表达分析筛选。其中GAPDH和EF-1在核桃所有样品中均表达稳定,但表达丰度偏低,适合作为表达丰度较低的目标基因内参;18S rRNA在核桃所有样品中表达稳定性较好,且18S rRNA表达丰度偏高,适合作为分析较高表达丰度目标基因时的内参;β-Actin和UBQ在核桃样品中的表达稳定性较差,不适合作为核桃中基因表达分析时的内参基因。(3)供试的2个铁核桃品种膜质种皮内总酚和芦丁含量显著高于其他器官,子叶中含量最低;叶片中总黄酮显著高于其他器官,青皮中含量最低。叶片发育过程中,2个品种中的总酚含量整体呈上升趋势;芦丁含量变化规律不明显。青皮中总酚及芦丁含量呈先降后升再降的变化趋势。膜质种皮中总酚含量呈先升后降再升的变化趋势;芦丁整体上升。子叶中总酚含量呈上升趋势,后期略微下降;芦丁含量先降后升再降的趋势。(4)在铁核桃空间表达研究发现,10个相关酶活性均具有组织特异性,其中C4H、4CL、CHS、CHI、F3H、UGT、GT酶活性变化在两个品种中具有相似性,均在茎中活性最高。10个酶基因的表达也具有组织特异性,其中CHI、F3H在雌花中的表达量最高;F3’H、UGT、GT在膜质种皮中的表达量最高;C4H在根中的表达量最高;而PAL在叶片中表达量最低;CHS在茎中表达量最低。两个品种间基因表达的差异性主要体现在PAL、4CL、CHS、FLS,‘黔核7号’中PAL、4CL、FLS在雄花中的表达量最高;CHS在根中的表达量最高;在‘黔核6号’中PAL在茎中表达量最高;4CL在根中的表达量最高;CHS、FLS在叶片中的表达量最高。(5)铁核桃叶片发育过程中,多酚类物质含量与相关酶(除UGT外)活均呈负相关,且与PAL、4CL、CHS、CHI、F3H、F3’H、FLS酶活相关性达到差异显著水平;与PAL、CHI、F3H、F3’H、UGT基因表达量呈显著负相关,而与FLS、GT呈显著正相关。青皮发育过程中,多酚类物质含量与多数相关酶活性呈正相关,与PAL、C4H、4CL、CHI、FLS、UGT、GT达到显著水平;与PAL、F3H、FLS基因表达量呈显著负相关,与其他基因的相关性较弱。膜质种皮发育过程中,多酚类物质含量与C4H、CHI、F3’H、FLS、UGT、GT酶活性呈显著正相关,与4CL酶活呈显著负相关;与CHS、FLS、GT基因表达量呈显著正相关。子叶发育过程中,多酚类物质含量极低,且与相关酶活的相关性较弱,仅与CHS基因表达量呈显著正相关。
【学位单位】：贵州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S664.1
【部分图文】：

芦丁,化学结构,思路方法

究生学位论文铁核桃芦丁合成相关基的植物提供思路方法的借鉴。进展其在植物中的分布香苷，是天然的黄酮类化合物。为淡黄色粉末或甲醇；可溶于乙醇、甲酰胺、丙酮、乙酸乙酯；度在沸甲醇中 0.142 g/mL；沸乙醇中为 0.0167 g/g/mL；其熔点为 176 ~ 178°C，分子式为 C27H30O

序列,生物合成途径,芦丁

图 2 芦丁生物合成途径与涉及到的酶（Zhao et al.,2011）Fig.2 The rutin biosynthesis pathway and the related enzyme(Zhao et al.,2011)由于多种中间化合物的转变存在多条路线，使得整个芦丁的合成途径形成了复杂的网构。尽管如此，在转录组测序广泛应用的过程中已在某些植物中克隆得到该途径中大多基因全长或其表达序列（Baucher et al., 2003），此外，相关酶的生理功能及定位均有相关究及报道。.2.2.1 公共苯丙氨酸途径涉及酶类及其编码基因苯丙氨酸解氨酶(phenylalanineammonia-lyase, PAL)是苯丙烷途径的入口酶和限速酶，连初生代谢和次生代谢，主要催化莽草酸途径的产物 L-苯丙氨酸脱氨基生成能合成 HCA酸、木质素(1ignin)和类黄酮等物质的共同底物——反式肉桂酸。Koukol & Conn（1961次在大麦(Hordeum vugare)中发现 PAL 蛋白，随后 PAL 蛋白被证实广泛存在于植物、真菌母和藻类中。在研究中发现 PAL 蛋白由一个多基因家族编码，且不同的家族成员在序列能上都有一定差异(Franke et al., 2000)。PAL 蛋白在番茄(Lycopersicon esculentu )、马铃

吸光,核桃,琼脂糖电泳,比值

OD260/OD280 值介于 1.8 ~ 2.1 之间，OD260/OD230 值介于 2.0 ~ 2.3 之间（图3 右），表明 RNA 无污染，无降解，纯度高，满足后续实验的要求。图 3 核桃样品 RNA 琼脂糖电泳图(左)及吸光比值测定图(右)Fig.3 RNA agarose gel electrophoresis (left) and light absorption ratio(right) of J. sigillata4.1.2 铁核桃芦丁合成相关基因的 RT-PCR 扩增取 1 μg总 RNA，以反转录 cDNA 为模板，用基因特异引物分别进行 PCR 扩增，扩增产

【参考文献】