棉花GhPDC-E1α克隆及调控基因表达模式研究
发布时间：2020-09-16 16:01
细胞质雄性不育系是作物杂种优势利用的主要途径。前人研究成果表明,细胞质雄性不育与能量代谢有关,能量代谢失衡会引起花粉异常发育。丙酮酸脱氢酶(PDC)是生物体能量代谢的枢纽,通过催化能源物质丙酮酸氧化脱羧,将糖酵解途径和三羧酸循环途径联系起来。丙酮酸脱氢酶E1α亚基是PDC活性的关键调控部位,PDK与PDP通过对PDC-E1α亚基丝氨酸的羟基基团进行磷酸化/去磷酸化反应,共同调节PDC活性的稳态,本研究以棉花细胞质雄性不育系晋A、亚棉A及其各自的同核异质保持系为研究对象,克隆了GhPDC-E1α、GhPD 与GhPDP的基因组DNA和cDNA;分析了三个基因在小孢子不同发育时期的表达模式;测定了小孢子不同发育时期的丙酮酸含量,初步研究了能量代谢异常对棉花小孢子发育的影响。研究结果如下:1.采用同源克隆的方法,获得了GhPDC-E1α、和GhPDP基因组DNA和cDNA序列。结果显示:GhPDC-E1α在不育系和保持系中基因组DNA长度不同,在晋A、亚棉A不育系和保持系中分别为8655bp、8672bp、8658bp,含有8个外显子和7个内含子;cDNA全长均为1185bp,编码394个氨基酸,氨基酸序列在不育系和保持系间存在单个位点的差异:通过氨基酸序列多重比对发现:PDC-E1α在植物中高度保守,含保守的TPP结合结构域、4个保守功能区以及两个丝氨酸磷酸化位点。对GhPDK基因组DNA和cDNA进行克隆,结果表明:在不育系和保持系中GhPDK基因组DNA全长均为2232bp,由6个外显子和5个内含子组成;cDNA全长为1110bp,编码369个氨基酸,不育系与保持系中GhPDK氨基酸序列相似度达到99%;保守结构域分析发现,PDK在植物中高度保守,含有类组氨酸激酶结构域,可以进行自磷酸化。对GhPDP基因组DNA和cDNA进行克隆,结果表明:GhPDP在不育系和保持系中基因组DNA长度不同,在晋A、亚棉A不育系和保持系中分别为2007bp、2016bp、2008bp,均含有4个外显子和3个内含子:cDNA全长均为1152bp,编码383个氨基酸。该基因属于PP2C家族蛋白,依靠Mn2+发挥活性,结构域保守。2.采用qRT-PCR,以小孢子败育前、败育时期、败育后3个时期的花蕾为研究材料,对GhPDC-E1α、GhPDK和GhPDP基因的表达模式进行分析。结果表明:在小孢子败育前,晋A不育系中GhPDC-E1α的表达量与保持系无差别,而在小孢子败育时期和败育后却均极显著低于保持系;在小孢子败育前和败育后时期,GhPDK的表达量均极显著高于保持系,在小孢子败育时期差异不显著;GhPDP的表达量在整个小孢子发育过程中均显著高于保持系;而保持系中GhPDK和GhPDP的表达量在小孢子发育过程中均无显著变化。可能由于GhPDP过表达,使晋A不育系在小孢子败育时期代谢过强,ROS增多,使膜脂过氧化,从而引起绒毡层提前降解,导致花粉败育。在小孢子发育过程中,亚棉A不育系中GhPDC-E1α的表达量与保持系无差别,而在小孢子败育时期和败育后却均极显著低于保持系;GhPDK的表达量均低于保持系,且在败育前和败育时期表达量差异极显著,败育后差异不显著;GhPDP的表达量在小孢子败育前和败育时期与保持系相差不大,而败育后显著低于保持系。推测可能由于亚棉A不育系中GhPDC-E1α亚基蛋白含量低于正常水平,可能会抑制丙酮酸转化为乙酰辅酶A,导致不能产生足够的能量来满足小孢子的发育,从而引起花粉败育。综合分析GhPDC-E1α、GhPDK、GhPDP基因在不育系和保持系间的表达特征并结合我们之前的研究认为,晋A、亚棉A两种细胞学败育特征不同的细胞质雄性不育系,虽然在小孢子发育过程中,均出现能量代谢异常,但导致小孢子败育的机理不同。3.对不育系和保持系小孢子发育过程中丙酮酸含量进行测定。结果表明,晋A不育系中丙酮酸含量在小孢子发育过程中与保持系无显著差异,说明晋A不育系小孢子的败育并不是由于能量代谢底物差异造成的,可能是由于其能量代谢途径中的酶调控失衡引起的。亚棉A不育系在小孢子发育过程中丙酮酸含量均高于保持系,且在小孢子败育时期差异显著,丙酮酸的积累可能抑制三羧酸循环的进行,导致小孢子发育过程中能量不足。
【学位单位】：山西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S562
【部分图文】：
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本文编号：2820056
【学位单位】：山西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S562
【部分图文】：
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本文编号：2820056
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