柑橘Mlo基因的克隆与遗传转化

发布时间：2020-09-17 12:57

　　柑橘是我国栽培面积最大的果树,其果实品质深受柑橘病害的影响,为减少化学药剂的使用,培育柑橘的抗病品种成为了柑橘病虫害防治的最有效最直接的选择。随着基因工程技术的发展,基因育种越来越受到人们的重视,对于柑橘抗病基因的研究也愈发深入。柑橘真菌性病害如柑橘褐斑病、炭疽病等对树体、果实都有巨大的影响,对我国柑橘产业造成了严重影响。Mlo基因是一类新发现的植物抗病基因家族,不同于传统抗病基因R基因的“基因对基因”模式,其隐性等位基因mlo基因在许多植物如大麦、拟南芥、葡萄、番茄等中均表现出对真菌性病害白粉病的非专化广谱性抗性,在植物的抗病育种上Mlo基因表现出巨大的潜力,有很高的研究价值。但在柑橘中尚未有Mlo基因的相关研究报道,因此本试验对柑橘的Mlo基因家族成员进行了相关研究,主要研究结果如下:1、通过对从数据库获得的柑橘基因序列进行比对和保守结构域分析获得了15个具有Mlo基因家族保守结构域的柑橘(克里曼丁,Citrus clementina)CiMlo基因家族成员。对这15个CiMlo基因家族成员的蛋白质基本理化性质、跨膜结构域、保守结构域、信号肽和亚细胞定位进行了预测。发现这15个CiMLO蛋白均为弱碱性蛋白;其中9个CiMLO蛋白为疏水性的稳定蛋白;具有6-8个跨膜螺旋结构域;仅CiMlo242和CiMlo446两个蛋白预测有信号肽,其余13个CiMLO蛋白预测没有信号肽;亚细胞定位预测显示15个CiMLO蛋白均定位在细胞膜上。系统发育分析显示进化树分为7个分支,柑橘的15个CiMlo基因分散在7个分支中,其中包括CiMlo092和CiMlo281在内的8个基因与已报道的其它植物中与白粉病互作相关的基因处于相同分支。从二倍体克里曼丁的叶片中克隆得到了CiMlo092和CiMlo281两个基因的完整CDS序列,经比对发现其序列具有完整的开放阅读框,与数据库中Ciclev10028092、Ciclev10031281两个基因的CDS序列完全一致。2、利用实时荧光定量PCR技术对CiMlo092和CiMlo281基因在褐斑病感病品种LW10、金秋砂糖橘、红桔、抗病品种LW40、大雅、无核沃柑和炭疽病感病品种LW24、抗病品种LW12的叶片中的表达进行了分析。发现CiMlo092基因在褐斑病菌诱导后表达量有明显提高,且在感病品种中响应比抗病品种更快,CiMlo281基因表达量也有显著上升,但在各个品种中变化规律不明显。在炭疽病菌诱导后,在抗病和感病品种中两个基因表达量明显下调,仅在第7天略微有所上调,随后又降低。3、构建了CiMlo092和CiMlo281两个基因的超量表达载体和干扰载体,并通过基因克隆重组技术,验证获得了超量表达重组质粒CiMlo092-D17、CiMlo281-D17,和干扰载体重组质粒pGBI-CiMlo092、pGBI-CiMlo281。通过农杆菌介导转化和植物组织培养获得了柑橘再生芽和烟草再生幼苗,为后续抗病性评价提供材料。将CiMlo092和CiMlo281两个基因的超量表达载体转入烟草叶片中对两个基因进行亚细胞定位,结果显示该两个基因均定为在细胞膜上。
【学位单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S666
【部分图文】：

病原菌,抗病性,互作,植物

2003）诱发更强大的防御反应以抵御病原菌的入侵如图1-1。R 基因介导的寄主性抗性一般在感病物种的抗病基因型个体中表达，寄主性抗性通常具有病原特异性，即寄主性抗性仅限于对特定的病原菌而且通常是该病原菌特定的基因型具有抵抗作用（Hammond-Kosack K E，1997）。图 1-1 植物与病原菌的互作以及抗病性的发展（MayankAnand Gururani，2012）Fig.1-1 The interaction between plants and pathogens and the development of disease resistance1.1.2. 植物防卫反应植物受外界病原入侵时在抗病机制的调控下会发生一系列的防卫反应，其防卫反应主要包括两种措施。第一是细胞壁结构的增强，植物在受到病原体侵染和受到损伤时，将调控增加木质素的合成量以提高细胞壁的厚度；甘氨酸蛋白和强脯氨酸糖蛋白这两类细胞壁结构蛋白也将增加合成量以巩固细胞壁的结构；同时过氧化物酶催化苯基类丙烷醇经过脱氢聚合等一系列反应最终生成木质素，该木质素可抵抗微生物的降解并催化细胞壁蛋白与多糖分子之间的交联。第二是诱导

植物抗病基因,特征分类,氨基酸

构域以及 C 端的一个胞内丝-苏氨酸蛋白激酶结构域（SongWY，1995），如水的抗白叶枯病基因 Xa21。第五类 R 基因 TrD-CC，这类蛋白质由跨膜结构域 T和卷曲螺旋结构构成，以拟南芥抗白粉病基因 RPW8 为代表（Wang W，2009第六类 R 基因 LRR-TrD-PEST-ECS，这类以番茄的 VE1、VE2 基因为代表的蛋质中包括推测存在的胞外 LRRs 结构，和一个与蛋白质降解有关的 PEST （PGlu-Ser-Thr）模块以及一个介导受体进入细胞的短蛋白序列（ECS）（Thomma H J，2011）。第七类 R 基因 TIR-NBS-LRR-NLS-WAKY，该类蛋白除了含有 TINBS-LRR 结构外，在其 C 端还有一个核定位信号肽，N 端有一个由 60 个氨酸组成的 WRKYGQK 保守结构域以及一个类似锌指序列的结构（Deslandes 2003；2002）。第八类 R 基因酶促 R 基因，这类基因没有 LRR 和 NBS 结构，如人类发现的第一个植物抗病基因玉米抗玉米圆斑病基因 Hm1，它编码一种 H四肽毒素还原性酶（Toxinreductase），该酶能有效降解病原菌所产生的毒素从起到抗圆斑病的功效（Gurmukh and Steven， 1992），此外还有大麦的抗锈病因 Rpg1 编码的一种不含膜定位结构含两个串联蛋白的受体激酶（BrueggemanR2002）。（图 1-2）

拓扑结构图,基因家族,拓扑结构

图 1-3 Mlo 基因家族的常见拓扑结构（Devoto et al，1999）Fig.1-3 A common scaffold topology for the Mlo family3. Mlo 基因的抗病机制随着对 Mlo 基因研究的不断加深，越来越多的研究证明野生型 Mlo 是防卫机制的负调控基因子，在已有的研究中表明 Mlo 基因负向调控植应，Mlo 基因家族的成员在调节植物细胞死亡的过程中起着至关重要的üschges et al， 1997； Piffanelli et al， 2002），同时也是大麦中白粉病寄主细胞的必须蛋白（Panstruga， 2005），而其变体 mlo 基因在多种植、葡萄、小麦、水稻等中都表现出对白粉病的非小种广谱性抗性，这说明与 Mlo 基因在功能上互补。对 mlo 基因抗病机制的研究主要集中在五解除植物细胞过敏性坏死，与 Ror 基因抗病的关系，与钙调素（CAM）与 G 蛋白偶联受体蛋白功能的关系，乳突结构与 mlo 基因的抗病功能当病原菌入侵植物活体组织时，寄主植物在感病部位会迅速诱导局部的，这种反应叫做过敏反应（HR）。细胞过敏性坏死一直被认为是植物抗

【参考文献】