SRSF1在GT1-7细胞模型中参与性发育相关基因转录后调控机制的研究

发布时间：2020-09-21 19:28

　　 性发育是个体成熟并获得生殖能力的过程,受到遗传、营养、环境等多种因素的影响。性发育的调控依赖于一个有多条通路共同组成的复杂基因网络。本课题组前期在近交系小鼠的X染色体上发现了一个推迟小鼠性发育启动的基因miR-505,实验证明丝氨酸/精氨酸富集的剪接因子1(SRSF1)就是miR-505的靶基因,并且SRSF1能够缓解miR-505对性发育相关基因促性腺激素释放激素(Gn RH)、Kiss1的抑制作用。本研究基于上述背景,在GT1-7细胞中,利用短发夹RNA(sh RNA)慢病毒构建低表达SRSF1的稳转株,确定SRSF1与性发育相关基因GnRH、Kiss1之间的关系。利用敲低SRSF1的稳转株和pGT1-7细胞进行RNA测序(RNA-seq)和蛋白质组学的研究,找到SRSF1参与影响性发育相关基因的信号通路,并初步探索miR-505和SRSF1影响性发育相关基因的分子机制。构建SRSF1敲低的稳转株,用包含SRSF1-shRNA载体的慢病毒感染小鼠下丘脑永生化的神经元细胞GT1-7,获得稳定敲低SRSF1的细胞株。并检测稳转株中性发育相关基因GnRH、Kiss1的表达量。在mRNA水平,用高通量的测序转录组分析技术——RNA-seq对稳转株进行表达谱检测。并用生物信息学对测序结果进行分析,用TopHat将reads比对到基因组上,比对上的reads经过Cufflinks形成转录本,Cuffdiff对这些转录本进行分析得到差异表达的基因。后续对这些差异基因进行GO分析和KEGG pathway分析。在蛋白质水平,用高通量筛选技术——稳定同位素标记的相对和绝对定量技术(iTRAQ)对稳转株进行差异蛋白的筛选。并用Ingenuity Pathway Analysis(IPA)软件对差异蛋白进行分子功能、基因网络和信号通路的分析。Real-time PCR和Western blot检测GT1-7细胞中SRSF1在mRNA和蛋白水平的变化,发现SRSF1敲低效率分别为45%(P0.001)和42%(P0.05),即成功构建了敲低SRSF1的稳转株shRNA-SRSF1-GT1-7。稳转株中性发育相关基因GnRH、Kiss1在mRNA水平分别降低35%(P0.01)和46%(P0.001)。说明SRFS1影响了性发育相关基因的表达。RNA-seq在shRNA-GT1-7-SRSF1细胞中共检测到3161个表达差异的基因,其中上调的有1407个,下调的有1754个。在过表达mir-505的细胞pGT1-7中共检测到3034个表达差异的基因,其中上调的有1357个,下调的有1677个。两种细胞中的差异基因大多数位于细胞质,具有结合、激活的功能。在KEGG分析中,代谢通路、癌症通路、γ-氨基丁酸能突触、PI3K-Akt信号通路在两种细胞中都被富集到,pGT1-7细胞的差异基因还参与胰岛素分泌和GnRH信号。iTRAQ在两种细胞中检测到了4945个蛋白质,shRNA-GT1-7-SRSF1中有102个差异蛋白质(fold change在1.3倍之上,p值小于0.05),pGT1-7中有173个差异蛋白质(fold change在1.3倍之上,p值小于0.05)。这些差异蛋白有一半以上位于胞质,同RNA-seq。shRNA-GT1-7-SRSF1中的差异蛋白主要参与γ-氨基丁酸降解的信号通路、胰岛素受体信号通路及AMPK信号通路。在pGT1-7细胞中γ-氨基丁酸降解的信号通路和PI3K-Akt信号通路被富集到。通过Real-time PCR验证,说明RNA-seq和iTRAQ的结果较为可靠。综上所述,我们推测SRSF1可能是通过γ-氨基丁酸降解信号通路、AMPK信号通路和PI3K-Akt信号通路发挥功能。这个研究为后续更深入的解析SRSF1影响性发育的分子机制研究提供一个理论基础。
【学位单位】：东华大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：Q756
【部分图文】：

因如

在冻存管上记录好细胞名称，冻存日期，冻存火后，用封口膜封口，放入冻存盒。把冻存盒放入-冻存管，放入液氮中，记录好放入的位子，方便日后建导 shRNA 的获得载体由和元生物技术（上海）有限公司构建，首先针对 shRNA 干 扰 片 段 ， 将 该 干 扰 片 段 插 入 慢PR-U6-shRNA 中，载体如图 2.1。该载体含有 CMV色荧光蛋白基因 mcHerry 和嘌呤霉素抗性基因 Puro。同时 CMV 启动红色荧光蛋白基因和嘌呤霉素抗性察载体感染病毒的效率，嘌呤霉素抗性方便筛选目的的慢病毒载体由和元生物技术（上海）有限公司进行的滴度为 shRNA-1： 4.42E+08；shRNA-2：2.92E+

图 2-2 RNA-seq 测注：图片来源为公司合同。2.2.7.1 样品的准备按 2.2.3 描述的方法抽提 RNA，N所示。用冰袋寄送样品。表 2-10 RNA样品 浓度GT1-7 435 ng/μGT1-7 430 ng/μshRNA-SRSF1-GT1-7 599 ng/μshRNA-SRSF1-GT1-7 594 ng/μpGT1-7 471 ng/μpGT1-7 478 ng/μ

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5 高燕;宋W

本文编号：2823898