红松四个功能基因的克隆与分析

发布时间：2020-09-25 22:13

　　 红松(Pinus koraiensis Sieb.et Zucc.)主要生长分布于中国东北东部山区,具有重要的经济价值及生态价值。肉桂醇脱氢酶(Cinnamoylalcohol dehydrogenase CAD)催化木质素还原反应中的第二步反应,即将三种肉桂醛:咖啡醛,松柏醛,5-羟基松柏醛还原为三种肉桂醇:咖啡醇,松柏醇,5-羟基松柏醇。内根-贝壳杉烯合成酶(ent-Kaurene synthase KS)在赤霉素合成途径中催化柯巴焦磷酸盐(CPP)合成内根-贝壳杉烯,是赤霉素合成途径中前期的关键步骤。GA20氧化酶(GA 20-oxidase GA20)在与GA3氧化酶,GA2氧化酶等协同作用下,将GA12-醛转化为各种具有生物活性的GA。几丁质酶(Chitinase Chi)在植物中主要作为抵御虫病害,抗低温的抗逆性蛋白发挥作用。通过对红松以上几种酶的研究,可为红松种子,木材的产量,产率与红松植株抗病害方面做出贡献。本实验利用同源序列克隆法从红松中克隆得到了红松CAD,KS,GA20,Chi基因,并将以上四基因分别与表达载体连接后在大肠杆菌BL21细胞中进行表达。为提高红松木材,种子产量,提高抗病性研究打下了基础,研究结果如下:1,对红松CAD基因进行了克隆测序,结果表明:红松CAD基因全长为1074bp,所编码蛋白质包含357个氨基酸,分子量为38.9kd,分子式为C_(1714)H_(2741)N_(455)O_(517)S_(29,)等电点为5.80。与其他物种CAD基因进行多序列对比结果表明,红松CAD基因序列与火炬松,挪威云杉等具有较高一致性,其亲缘关系较近。构建系统进化树分析结果表明,与红松CAD基因亲缘关系最近的是辐射松和火炬松。将红松CAD基因序列上传至Genbank,登录号为MG764438。将红松CAD基因在大肠杆菌BL21细胞中表达,SDS-PAGE电泳结果显示,转入红松CAD基因表达载体的工程菌表达了长度约为39kd的蛋白,与理论预期相符。2,对红松GA20基因进行了克隆测序,结果表明:红松GA20基因全长为1116bp,所编码蛋白质包含371个氨基酸,分子量为42.03kd,分子式为C_(1893)H_(2911)N_(511)O_(543)S_(16),等电点为6.89。与其他物种GA20基因进行多序列对比结果表明,红松GA20基因序列与油松,白云杉等具有较高一致性,其亲缘关系较近。构建系统进化树分析结果表明,与红松GA20基因亲缘关系最近的是油松和赤松。将红松GA20基因序列上传至Genbank,登录号为MG764439。将红松GA20基因在大肠杆菌BL21细胞中表达,SDS-PAGE电泳结果显示,转入红松GA20基因表达载体的工程菌表达了长度约为42kd的蛋白,与理论预期相符。3,对红松KS基因进行了克隆测序,结果表明:红松KS基因全长为2283bp,所编码的蛋白质包含760个氨基酸,分子量为85.96kd,分子式为C_(3815)H_(6006)N_(1050)O_(1131)S_(40),等电点为6.10。与其他物种KS基因进行多序列对比结果表明,红松KS基因序列与白云杉具有较高一致性,其亲缘关系较近。构建系统进化树分析结果表明,与红松KS基因亲缘关系最近的是辐射松和白云杉。将红松KS基因序列上传至Genbank,登录号为MG764440。将红松KS基因在大肠杆菌BL21细胞中表达,SDS-PAGE电泳结果显示,转入红松KS基因表达载体的工程菌表达了长度约为86kd的蛋白,与理论预期相符。4,对红松Chi基因进行了克隆测序,结果表明:红松Chi基因全长为831bp,所编码的蛋白质包含276个氨基酸,分子量为28.27kd,分子式为C_(1220)H_(1874)N_(340)O_(393)S_(21),等电点为8.64。与其他物种Chi基因进行多序列对比结果表明,红松Chi基因序列与白云杉,挪威云杉等具有较高一致性,其亲缘关系较近。构建系统进化树分析结果表明,与红松Chi基因亲缘关系最近的是挪威云杉,北美云杉。将红松Chi基因序列上传至Genbank,登录号为MG764441。将红松Chi基因在大肠杆菌BL21细胞中表达,SDS-PAGE电泳结果显示,转入红松Chi基因表达载体的工程菌表达了长度约为28kd的蛋白,与理论预期相符。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S791.247;Q943.2
【部分图文】：

图 1.1 木质素构成基质的三种苯丙烷衍生物结构素合成途径主要由三个过程：1，莽草酸途径；2，类苯丙酸途径。第一步莽草酸途径是植物进行光合作用合成葡萄糖，并将葡萄糖

图 1.2 木质素合成途径肉桂醇脱氢酶（CAD）是木质素合成途径中特异途径的关键酶之一，催化香豆醛，芥子醛，松柏醛等肉桂醛合成相应的肉桂醇作为木质素单体的前体。目前

图 1.3 赤霉素主要生物合成途径目前赤霉素对红松球花分化，结实时间等方面的影响已经得到证实[33]。孙文对随机分组红松用不同浓度的赤霉素 GA3+GA4/7 诱导红松球花分化，结果表

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本文编号：2827134