番茄碳同化相关基因共表达载体构建及遗传转化研究

发布时间：2020-10-10 04:23

　　山西省是设施蔬菜生产大省,温室内CO_2亏缺是制约温室蔬菜提质增效的重要因素。为研究番茄响应低浓度CO_2基因的功能,以及探讨光合碳同化相关基因共表达对番茄应答低浓度CO_2的作用,本试验以番茄“合作908”为材料,克隆了番茄碳同化相关基因/cCA1、和FBA,通过构建βCA1+SBP+FBA多基因共表达载体,利用农杆菌介导法进行番茄遗传转化,最终获得βCA1、SBP和FBA三个基因共同表达的番茄转基因植株。主要研究结果如下:(1)从番茄叶片中克隆了番茄碳同化相关的βCA1、SBP和FBA;(2)利用连接肽“2A”构建了含βCA1、SBP和FBA的多基因共表达载体;(3)对番茄再生体系进行了优化,筛选出褐化程度低的番茄再生体系:诱茅培养基:MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IAA+500 mg/L Cef+400 mg/mL PVP/40,生根培养基 MS+0.1 mg/L IAA+250 mg/L Cef;(4)利用农杆菌介导法进行番茄遗传转化,获得了高表达βCA1、SBP和FBA的番茄T1代转基因植株。
【学位单位】：山西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S641.2
【部分图文】：

表达载体构建,策略

个基因间加有连接肽“２Ａ”和引导肽ＳＳＵ，当融合基因进入真核生物体内表达时，连逡逑接肽“２Ａ”会发生自我剪切，引导肽ＳＳＵ会带有不同的目的基因进入到生物体内各逡逑自发生反应的部位进行表达。构建策略如图２－１。逡逑Ｎｃｏｌ逦ＢｓｔＥＩＩ逡逑Ｉ邋Ｉ逡逑ＲＢ邋ＰＣＡ１逦２ＡＳＳＵ邋ＳＢＰ逦２Ａ邋ＳＳＵ逦ＦＢＡ逦ＬＢ逡逑图２－丨表达载体构建策略逡逑Ｆｉｇ邋２－１邋Ｅｘｐｒｅｓｓ邋ｖｅｃｔｏｒ邋ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ邋ｓｔｒａｔｅｇｙ逡逑在２２０邋ｒ／ｍｉｎ，３７°Ｃ的震荡培养器中，把含有ＰＣ４／＋仰Ｐ＋ＦＳ／Ｉ多基因的大肠杆菌和逡逑表达载体ＰＣＡＭＢＩＡ１３０１菌液分别放入含有Ａｍｐ和Ｋａｎａ抗生素的ＬＢ液体培养基中逡逑培养直至有明显浑浊，利用质粒小提中量试剂盒提取质粒，把多基因共表达载体质粒逡逑与ＰＣＡＭＢＩＡ１３０１表达载体质粒进行双酶切，凝胶电泳检测并回收目的片段，与逡逑ＰＣＡＭＢＩＡ１３０１表达载体连接，如图２－２。构建好多基因共表达载体逡逑后转化到ＤＨ５ａ感受态中，涂布在加有Ｋａｎａ抗生素的ＬＢ平板上，挑取单菌落进行菌逡逑液ＰＣＲ验证和测序

构建策略,表达载体

条带,退火温度

凝胶电泳可以清楚的得出，在不同温度下ＰＣＲ扩增条带清晰度不？致，尽可能选择清逡逑晰度好、温度高的孔样温度作为最适退火温度，经过分析，最终确定和划／１的逡逑最适退火温度为５８．８°Ｃ，见下图３－２中Ａ和Ｂ，逦的最适退火温度为５６．９°Ｃ邋，见下逡逑图３－２中Ｃ，筛选出最适退火温度后用于后续目的基因＾ＣＶ１７、Ｆ似全长序列进逡逑行扩增。逡逑－１７－逡逑

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