杉木生长素早期应答基因SAUR的克隆与功能分析

发布时间：2020-10-10 16:57

　　 杉木(Cunninghamia lanceolata(Lamb.)Hook)是我国南方重要的速生用材树种之一,因其具有材质优良和速生丰产等特点被广泛种植,在我国林业生产中占据重要地位。长期林业生产实践表明,铝毒是我国南方酸性土壤中制约杉木生长,导致杉木人工林产量下降的主要原因之一。因此如何改善酸性土壤上杉木的生长,提高杉木人工林产量已成为当前亟待解决的问题。与其他植物一样,杉木在酸性土壤中的生长发育是一个动态变化的过程,它通过不断整合自身发育与环境信号,实现对自身生长发育的调控。作为调控植物生长发育关键激素之一,生长素在介导植物响应环境和自身发育信号中扮演着关键角色。尽管生长素在调控植物铝胁迫耐性中的作用早已被证实。但是,这一过程涉及生长素信号转导途径的一系列基因和调控元件,而生长素早期应答基因SAUR作为生长素信号转导途径的上游基因,在介导生长素对植物生长发育和非生物胁迫调控过程中扮演着关键角色。然而,迄今为止介导生长素调控植物铝胁迫耐性的分子机制尚不完全清楚。因此,开展杉木ClSAUR基因家族及启动子克隆、不同生理条件下的表达模式分析和铝胁迫下基因功能研究,对于明确ClSAUR基因在杉木生长发育和铝胁迫中的作用和地位,加深对ClSAUR基因在杉木生长发育和铝胁迫中的调控作用机制的了解,并为进一步利用基因工程手段改良杉木抗性,从而最终提高铝胁迫下杉木人工林的产量提供理论依据。主要研究结果如下:1、杉木ClSAUR基因家族的克隆与生物信息学分析利用RT-PCR和RACE技术,从杉木组培苗中克隆得到8个ClSAUR基因家族成员的cDNA和gDNA序列。生物信息学分析结果表明,杉木ClS4 UR基因家族均不含内含子,所编码的氨基酸个数在95～196之间,且所有ClSAUR蛋白均为定位于细胞质的不具有跨膜结构的非分泌蛋白。同时,除ClSAUR25为酸性蛋白、ClSAUR36为稳定蛋白及ClSAUR29为疏水性蛋白外,其余杉木ClSAUR蛋白成员为碱性亲水的不稳定蛋白。功能结构域分析显示,ClSAUR蛋白家族均属于生长素诱导的超家族成员,含有PLN结构。杉木ClSAUR蛋白不同成员在磷酸化位点数和位置上差异较大,且大部分杉木ClSAUR蛋白成员的磷酸化修饰主要是以丝氨酸为主。蛋白结构分析表明,ClSAUR2、ClSAUR24、ClSAUR25、ClSAUR29、ClSAUR36和ClSAUR39均以无规卷曲为主,而ClSAUR50和ClSAUR91则以α螺旋为主。2、杉木ClSAUR25基因的启动子克隆及序列分析通过热不对称PCR反应从杉木基因组DNA中获得长为1471 bp的ClSAUR25基因5'调控序列,该5'调控序列具有3个核心启动子区,分别位于第226～276bp、第1034～1084bp和第1234～1284 bp上,且3个核心启动子区的可能转录起始位点均为C。进一步分析发现该5'调控序列共有5个CpG岛,分别位于第1148～1347 bp、1149～1348 bp、1150～1349 bp、1151～1350 bp和1152～1351 bp。顺式作用元件分析表明,该5'调控序列不仅含有丰富的核心元件CAAT-box和TATA-box,还存在光响应元件、乙烯响应元件、金属响应元件、厌氧响应元件、分生组织特异性元件、胚乳表达元件、生理周期响应元件及大量功能未知元件。此外,ClSAUR25基因可能还受bZIP类转录因子调控。3、不同生理条件下杉木ClSAUR基因家族的表达分析利用qPCR技术分析了杉木ClSAUR基因家族在愈伤组织不同形成时期、不同组织部位以及生长素不同处理时间的表达情况。结果表明ClSAUR基因家族不同成员在愈伤组织形成的不同阶段表达存在明显差异,ClSAUR2和ClSAUR24基因表达主要在杉木愈伤组织诱导初期和分化期受到显著诱导,ClSAUR25基因表达量在杉木愈伤组织诱导、分裂及分化整个生长过程中均显著上调,ClSAUR50、ClSAUR91和ClSAUR39则主要在杉木愈伤组织诱导初期受诱导表达,暗示ClSAUR基因家族不同成员在杉木愈伤组织发育过程的不同阶段扮演着不同的角色。ClSAUR基因家族不同成员组织特异性表达结果表明,不同基因成员或同一基因在不同组织中的表达存在显著差异,其中ClSAUR2和ClSAUR39基因在叶片的相对表达量最大,ClSAUR25、ClSAUR50和ClSAUR91基因在根中相对表达量最大,ClSAUR24基因则在茎中相对表达量最大,暗示不同家族成员在不同组织部位所起的功能有所不同。此外,不同ClSAUR成员对生长素的响应情况也存在差异,其中ClSAUR24、ClSAUR25、ClSAUR39和ClSAUR91基因对生长素响应较为迅速(0.5 h就能被显著诱导表达),随后这些基因表达量均呈现先上升后下降的趋势,说明这些基因在早期生长素信号转导过程中起着重要作用。而ClSAUR2在早期(0.5 h)则被生长素迅速抑制表达,随后其表达量呈先下降后上升再下降的趋势,暗示其可能在生长素信号转导后期发挥着特定的功能。与上述生长素响应基因表达模式不同的是,ClSAUR50基因的表达相对复杂,其相对表达量整体变化呈先上升后下降再上升的趋势。4、杉木ClSAUR25基因的功能分析将ClSAUR25基因ORF构建到pCambia1301-1表达载体中,采用农杆菌侵染法将p1301-ClSAUR25导入拟南芥和烟草中,获得拟南芥转基因植株和转基因烟草组培苗。通过对转基因烟草内源激素含量分析,发现转基因烟草的lAA和ABA含量均高于野生型,而GA和ZR含量均低于野生型烟草。通过外源生长素对烟草进行处理,结果表明随着处理时间的延长,野生型和转基因烟草ClSAUR25的相对表达量呈先上升后下降的趋势,在1 h时两者的相对表达量显著提高并达到峰值。整体而言,野生型烟草的ClSAUR25相对表达量均显著低于转基因烟草的相对表达量。耐铝结果分析表明,铝胁迫显著增加烟草体内过氧化氢含量,而且转基因烟草中过氧化氢增幅小于野生型,与该结果一致的是,铝胁迫均显著诱导MDA的积累,但转基因烟草中MDA增幅小于野生型,表明转基因烟草受到的氧化损伤较野生型小,转基因烟草具有较强的耐铝性。铝胁迫下烟草体内可溶性糖和脯氨酸含量分析表明,铝胁迫显著增加野生型烟草中可溶性糖和脯氨酸以及转基因烟草体内脯氨酸的含量,但铝胁迫显著降低转基因烟草中可溶性糖含量,上述结果表明转基因烟草植株耐铝性的增强与其体内渗透物质含量的改变关系不大。另一方面,铝胁迫显著增加野生型烟草中的SOD活性,而转基因烟草中SOD活性变化不明显,但转基因烟草自身具有较高的本底SOD活性。铝胁迫显著增加野生型和转基因烟草中POD和CAT活性,而且铝胁迫下野生型烟草中POD酶活性增幅显著大于转基因烟草,铝胁迫下转基因烟草中CAT活性增幅显著高于野生型,表明转基因烟草可能通过提高CAT活性来增强其活性氧清除能力,减轻铝诱导的氧化损伤。此外,野生型和转基因烟草柠檬酸分泌基因NtMATE和铝的液泡转运基因NtALS3定量分析结果表明,铝胁迫能显著增加野生型和转基因烟草中NtMATE基因的表达量,铝胁迫下野生型和转基因烟草中NtMATE基因的表达量分别是各自对照的2.75和2.96倍,而且在正常和铝胁迫条件下转基因烟草NtMATE的表达量均显著高于野生型。另一方面,铝胁迫对野生型烟草NtALS3基因表达的影响并不显著,但铝胁迫却显著诱导该基因在转基因烟草中的表达,铝胁迫下其表达量是野生型的3.21倍,暗示铝胁迫下转基因烟草可通过增加NtMATE和NtALS3表达量,促进有机酸的分泌和铝向液泡中的转运,减少转基因烟草对铝的吸收,减轻铝的毒害,从而最终增强其对铝胁迫的耐性。
【学位单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S791.27
【部分图文】：

其调控作用是ＳＣＦＴＲ１／ＡＦＢ对转录调控因子Ａｕｘ／ＩＡＡ家族的蛋白酶解。其中泛素??连接酶复合物ＳＣＦＴＤＵ是由Ｆ－ｂｏｘ蛋白与ＡＳＫ１、ＣＵＬ１和ＲＢＸ蛋白组成［２Ｗ８］。ＡＲＦ??在生长素信号转导过程最为关键，处于转导路径的核心下游位置。由图１－２可认??为，在生长素浓度低的条件下，ＡＲＦ转录因子与Ａｕｘ／ＩＡＡ抑制子相结合，从而抑??制ＡＲＦ的活性，进一步抑制下游生长素响应基因的表达。相反，当生长素浓度较??高时，ＳＣＦ复合体与Ａｕｘ／ＩＡＡ抑制子结合能力过强导致被泛素化，从而被２６Ｓ蛋白??酶体降解，ＡＲＦ激活子便激活生长素基因［２９］，这意味着其参与了２６Ｓ蛋白亚基介??导的靶蛋白的降解［３ｅ］。目前，＾〇／／以基因显示了不同的诱导动力学，部分??基因在生长素处理条件下可数分钟后表达，而其它基因却表达延迟。??３??

２．３．１杉木总ＲＮＡ和基因组ＤＮＡ的提取结果??以杉木组培苗０２０为试验材料，提取杉木总ＲＮＡ，经１％琼脂糖凝胶电泳??及酶标仪检测，结果如图２－１，ＲＮＡ和ＤＮＡ条带完整，ＯＤ值均在１．８？２．０之??间，可知样品总ＲＮＡ和ＤＮＡ完整性好，杂质较少。质量检测合格的ＲＮＡ和??ＤＮＡ用于后续试验。??Ｍｉ?１?Ｍ２?２??２０００??７５〇ＩｍＨＩ??５〇〇?，」??２００??１００?＿＿＿＿＿??图２－１杉木总ＲＮＡ和总ＤＮＡ电泳图??Ｆｉｇ．２－１?Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｏｇｒａｍ?ｏｆ?ｔｏｔａｌ?ＲＮＡ?ａｎｄ?ｇｅｎｏｍｉｃ?ＤＮＡ?ｅｘｔｒａｃｔｅｄ?ｆｒｏｍ?Ｃ．ｌａｎｃｅｏｌａｔａ??注：Ｍｉ：?ＤＬ２，０００?ＤＮＡ?ｍａｒｋｅｒ；?１：总ＲＮＡ；?Ｍ２：人－Ｈｉｎｄ?ＩＩＩ?ｄｉｇｅｓｔ；?２：基因组ＤＮＡ??２．３．２杉木ａｓ＾ｆ／办基因保守片段克隆??以杉木组培苗总ＲＮＡ进行反转录得到的ｃＤＮＡ作为模板，根据所设计的??保守序列引物进行ＰＣＲ扩增（图２－２），ＰＣＲ产物经回收、连接转化及菌液验??证后，挑取阳性克隆子送华大测序，测序结果得到３１３?ｂｐ的保守序??列和４６５?ｂｐ的刃保守序列。将上述序列在ＮＣＢＩ上进行Ｂｌａｓｔ比对，均??与己登录的其他物种＆基因同源性较高

Ｍｌ?２３?４?Ｍ?５?６?７?８?９?１０??＿??图２￣４杉木Ｃ７Ｓ／４Ｗ？ｓ基因的ＯＲＦ序列电泳图??Ｆｉｇ．２－４?Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｏｇｒａｍ?ｏｆ?ＣＩＳＡＵＲ?ＯＲＦ?ｆｒｏｍ?Ｃ．ｌａｎｃｅｏｌａｔａ??注?２＊４：?Ｍ：?ＤＬ２，０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ：?１?和?２：?的?ＯＲＦ?产物（４８０ｂｐ）?；?３?和?４：?的??ＯＲＦ?产物（３１５ｂｐ）?；?５：?Ｃ／＆４ＷＷ＜５?的?ＯＲＦ?产物（５５８ｂｐ）?：?６：?的?ＯＲＦ?产物（５９１ｂｐ）；??７：?的?ＯＲＦ?产物（３４２ｂｐ）?；?８：?Ｃ／５＾Ｌ？５０?的?ＯＲＦ?产物（５１０ｂｐ）?：?９：?的?ＯＲＦ??产物（４０８ｂｐ）?；?１０：?的?ＯＲＦ?产物（２２８ｂｐ）．??２．３．５杉木沿基因的ｇＤＮＡ序歹｜Ｊ扩增??以杉木ＤＮＡ为模板，利用ＯＲＦ引物进行Ｃ／＆４Ｃ／＾基因的ｇＤＮＡ序列扩增??（图２－５），扩增产物经ＴＡ克隆及测序后，结果得到ＯＳ＾Ｗ？２、Ｃ／＆４Ｗ？％、??Ｃ！ＳＡＵＲ２５、ａＳＡＵＲ２９、ａＳＡＵＲ３６、ａＳＡＵＲ５０、ａＳＡＵＲ３９?及?ＣＩＳＡＵＲ９Ｉ?的?ｇＴ＾Ａ??序列大小分别为?４０８?ｂｐ、５９１?ｂｐ、３１５?ｂｐ、２８８?ｂｐ、５５８?ｂｐ、５１０?ｂｐ、３４２?ｂｐ?和??４８０?ｂｐ。??Ｍ１２?３４５６７８??图２－５杉木０＾［／沿基因的ｇＤＮＡ片段电泳图??Ｆｉｇ．２－５?Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｏｇｒａｍ?ｏｆ?ＣＩＳＡＵＲｓ?ｇ?ＤＮＡ?ｆｒｏｍ?Ｃｈｉｎｅｓｅ?ｆｉｒ??注?２－５：?Ｍ：?ＤＬ２
【参考文献】

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本文编号：2835339