小鼠免疫球蛋白基因γ1-C_H1外显子敲除表达重链抗体的研究

发布时间：2020-10-11 17:14

　　 免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig),又常被称为抗体,是机体抵御外界病原微生物入侵最重要的免疫分子之一。经典的免疫球蛋白由两条重链和两条轻链共同组成,仅由重链构成而不结合轻链的免疫球蛋白被称为重链抗体(Heavy chain only antibody)。重链抗体在正常情况下被认为是不正常的抗体类型,而在驼科动物及一些鱼类如鲨鱼、银鲛中,却天然存在重链抗体类型。驼科动物中的重链抗体相比较于经典抗体,具有明显的结构特点和在抗原结合方面的优势,所以近年来在实验室研究、试剂诊断和抗体药物研发等多个领域得到了广泛的应用。目前几乎所有重链抗体都来源于驼科动物,但驼科动物的饲养和免疫操作在很大程度上限制了重链抗体的广泛应用。基于此原因,我们试图利用遗传修饰小鼠来表达重链抗体。由于天然重链抗体都缺乏重链恒定区第一个结构域(CH1结构域),本论文通过删除小鼠中表达量最高的IgG1型抗体编码基因γ1的CH1外显子,在不修饰小鼠抗体可变区的情况下,研究小鼠是否能表达有功能的IgG1型重链抗体,为重链抗体的获得和应用提供新的思路和方法。本研究首先通过构建基因打靶载体,在小鼠ES细胞中,以neo基因定点替换掉了小鼠内源的γ 1-CH1外显子。通过PCR和Southern Blot的方法对于ES细胞基因型进行了鉴定,将打靶成功的小鼠ES细胞显微注射到小鼠囊胚中,得到以neo基因替换小鼠γ 1-CH1外显子的129Sv/JNeo+/Neo+小鼠品系。随后的研究发现该品系小鼠并不能正常表达分泌型的IgG1型抗体。因此通过Cre-loxP系统,对于外源neo基因进行了删除,得到了删除内源γ 1-CH1外显子而并不携带neo基因的HG1小鼠品系。进一步通过PCR和Southern Blot的方法对于HG1小鼠基因型进行了确证。通过RT-PCR的方法,对于HG1小鼠中γ1基因转录进行检测,发现其可以正常转录。随后的q-PCR实验表明γ1基因在HG1小鼠中转录水平较低,约为野生型小鼠中γ1基因转录水平的1/4。Western Blot实验检测到HG1小鼠血清中存在分泌型IgG1型抗体,通过特异性结合轻链的Protein L磁珠处理血清,证实了在HG1小鼠血清中的IgG1型抗体为预期的重链抗体类型。通过对小鼠脾脏和骨髓中B细胞流式分析检测发现,HG1小鼠骨髓中祖B细胞所占相对比例为32.91 ±3.54%,比野生型小鼠中显著提高(22.28± 1.76%,p0.05);前B细胞所占相对比例为66.33 ±3.71%,比野生型小鼠中显著降低(77.24 ± 1.8%,p0.05);未成熟B细胞和成熟B细胞在HG1小鼠中和野生型小鼠中所占比例类似,统计学意义上没有显著的差异。脾脏中浆细胞所占比例在HG1小鼠中极显著提高(p0.0001)。但是表达IgG1型抗体的浆细胞比例在HG1小鼠中显著降低(p0.001)。对于HG1小鼠中重链抗体的可变区序列分析发现,重链抗体偏好使用一些可变区家族如IGHV1家族,同时重链抗体结合抗原的关键区域CDR3也倾向于使用更长的氨基酸长度。ELISA测定小鼠血清中各种免疫球蛋白种类和亚型的含量发现,相比较于野生型小鼠,IgG1型重链抗体在HG1小鼠中表达量显著降低,约为野生型小鼠中IgG1型抗体表达量的1/3(p0.01)。其它免疫球蛋白种类和亚型表达水平呈现出不同程度的升高。通过抗原OVA的免疫实验,发现HG1小鼠中IgG1型重链抗体能够产生免疫反应,产生抗原特异性的IgG1型重链抗体。但是相比较野生型小鼠来看,HG1小鼠中免疫后抗原特异性重链抗体滴度较低,仅为200,928.3 U/mL,而野生型小鼠中这一数据高达3,212,742 U/mL,也说明HG1小鼠中重链抗体的免疫应答能力较弱。随后利用OVA抗原免疫后的HG1小鼠建立了重链抗体可变区的噬菌体文库,通过亲和筛选得到了 12条特异性的重链抗体可变区序列。以结合抗原的关键区域CDR3氨基酸序列作为筛选依据,选取其中5条序列进行了原核表达得到5株纳米抗体,分别为8#,10#,18#,35#,42#。对于这5株纳米抗体,通过ELISA实验检测了其对于抗原OVA的结合能力,发现只有10#和35#呈现出一定程度的抗原结合能力,其中10#结合能力最强。随后以生物膜层干涉技术,对于10#纳米抗体和抗原OVA的解离曲线进行测定,发现10#纳米抗体可以较好的结合抗原OVA纯品,但相比较于商品化抗体标准,其特异性和亲和力仍存在差距。综上所述,我以小鼠为研究对象,通过删除小鼠内源γ1-CH1外显子,得到了稳定表达IgG1型重链抗体的HG1小鼠品系。通过对于HG1小鼠品系的研究,发现其表达的IgG1型重链抗体能够产生较弱的免疫反应。随后通过噬菌体展示技术,从HG1小鼠中得到了特异性识别抗原OVA的纳米抗体。但与常规单克隆抗体相比,这些纳米抗体表现出较弱的抗原特异性和亲和力。本研究证实了利用遗传修饰小鼠表达有功能重链抗体的可能性,为重链抗体的来源及应用提供了一条新的思路和方法。
【学位单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：Q939.91
【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略词表
第一章 文献综述
    1.1 免疫球蛋白的结构和功能
        1.1.1 免疫球蛋白分子结构
        1.1.2 免疫球蛋白类型和基本功能
        1.1.3 免疫球蛋白基因组成和重链基因座位
    1.2 免疫球蛋白多样性产生机制
        1.2.1 V（D）J重组
        1.2.2 体细胞超突变
        1.2.3 基因转换
        1.2.4 类别转换重组
    1.3 B细胞发育及抗体的形成
    1.4 重链抗体
        1.4.1 重链抗体的发现
        1.4.2 驼科动物重链抗体序列和结构特点
        1.4.3 驼科动物重链抗体形成原因
        1.4.4 驼科动物重链抗体的优势和应用
    1.5 非天然重链抗体的研究进展
    1.6 抗体的筛选和制备
    1.7 研究目的和意义
第二章 材料与方法
    2.1 技术路线
    2.2 实验材料
        2.2.1 菌株、载体及细胞
        2.2.2 实验动物
        2.2.3 常用实验试剂
        2.2.4 实验用试剂盒
        2.2.5 常用试剂配制方法
    2.3 实验仪器设备
    2.4 实验方法
        2.4.1 DNA的提取
        2.4.2 RNA的提取
        2.4.3 PCR反应体系及反应条件
        2.4.4 反转录
        2.4.5 定量PCR
        2.4.6 5' RACE
        2.4.7 感受态细胞制备与效价测定
        2.4.8 克隆转化
        2.4.9 Western Blot
        2.4.10 Southern Blot
        2.4.11 流式细胞术
        2.4.12 Protein L纯化血清
        2.4.13 噬菌体文库的构建
        2.4.14 噬菌体文库亲和筛选
        2.4.15 抗体的原核表达和纯化
        2.4.16 小鼠免疫
        2.4.17 酶联免疫吸附试验（ELISA）
        2.4.18 斑点杂交
        2.4.19 统计分析
    2.5 生物信息分析软件及常用网站
第三章 结果与分析
    3.1 IgG1型重链抗体表达小鼠的构建
Neo+/Neo+小鼠构建'>        3.1.1 129Sv/J^Neo+/Neo+小鼠构建
Neo+/Neo+小鼠重链抗体表达的检测'>        3.1.2 129Sv/J^Neo+/Neo+小鼠重链抗体表达的检测
        3.1.3 HG1小鼠的建立
        3.1.4 IgG1型重链抗体的检测
        3.1.5 小结
    3.2 HG1小鼠血清中免疫球蛋白表达水平的检测
    3.3 HG1小鼠B细胞发育的研究
        3.3.1 HG1小鼠骨髓中B细胞发育的研究
        3.3.2 HG1小鼠脾脏中B细胞发育的研究
        3.3.3 HG1小鼠脾脏中浆细胞研究
        3.3.4 小结
    3.4 HG1小鼠可变区特点的研究
        3.4.1 HG1小鼠VH、DH和JH家族使用特点研究
        3.4.2 HG1小鼠抗体可变区CDR3长度特点研究
        3.4.3 序列保守性研究
        3.4.4 小结
    3.5 HG1小鼠免疫应答特点的研究
    3.6 HG1小鼠抗原特异性重链抗体或纳米抗体筛选
        3.6.1 HG1小鼠可变区免疫文库构建
        3.6.2 噬菌体文库的筛选
        3.6.3 噬菌体抗原特异性检测
        3.6.4 小结
    3.7 HG1小鼠来源纳米抗体表达和亲和力初步检测
        3.7.1 原核表达载体的构建
        3.7.2 纳米抗体表达检测
        3.7.3 纳米抗体抗原特异性检测
        3.7.4 小结
    3.8 HG1小鼠来源纳米抗体的纯化和亲和力验证
        3.8.1 纳米抗体的纯化
        3.8.2 纯化纳米抗体抗原特异性ELISA检测
        3.8.3 纯化纳米抗体抗原特异性斑点杂交检测
        3.8.4 纳米抗体抗原特异性的BLI检测
        3.8.5 小结
第四章 讨论与展望
第五章 结论
参考文献
附录
致谢
个人简历


本文编号：2836878