对虾是变温动物,不能通过自身来调节温度变化,而温度作为一个重要的环境因子,可直接影响对虾的生长、繁殖、代谢和存活等。中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)是冷水性虾类,对低温的耐受性较强,但放苗温度要求不低于14℃,且水温低于4℃时会大量死亡。凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)对低温的耐受性较差,适宜生长的温度为25~35℃,水温低于18℃时则停止摄食。低温限制了对虾的养殖季节和地域,影响养殖业的生产安全,而且采用锅炉升温等方法维持水温,不仅增加了成本、还污染环境。为解决由低温引发的诸多问题,加速培育出耐低温对虾新品种,本研究以中国对虾和凡纳滨对虾为实验材料,进行低温胁迫实验,并利用ASReml-R评估其耐低温和生长性状的遗传参数,再利用Illumina HiSeq 2500高通量测序技术筛选低温胁迫下的差异表达基因和与低温相关的代谢途径。主要结果如下:1.40日龄中国对虾生长和耐低温性状的遗传力评估G_(10)、G_(11)、G_(12)世代内40日龄中国对虾幼虾的体重(body weight,BW)的遗传力范围在(0.078±0.124)~(0.680±0.233)间,体长(body length,BL)的遗传力范围为(0.131±0.133)~(0.825±0.246),3个世代间BW、BL的遗传力分别为0.253±0.0888、0.206±0.0844,均为中等遗传力,且与0差异极显著(P0.01)。G_(10)、G_(11)、G_(12)代耐低温性状(CDH、TAD)的遗传力在(0.054±0.074)~(0.265±0.091)间,均为中低等遗传力。世代间的低温累积存活时间(cooling degree hours,CDH)和死亡时温度(temperature at death,TAD)的遗传力值分别为0.077±0.038、0.076±0.029,均为低等遗传力,且均与0有极显著性差异(P0.01)。2.40日龄中国对虾生长和耐低温两性状间相关性BW/BL的遗传相关和表型相关均为高度正相关。G_(10)、G_(11)、G_(12)世代内的BW/BL的遗传相关为(0.956±0.055)~(0.987±0.003),表型相关为(0.867±0.009)~(0.941±0.004),均为高度正相关,且与0存在极显著性差异(P0.01)。世代间的BW/BL的遗传相关为0.910±0.008,表型相关为0.902±0.004,同样均为高度正相关且与0差异极显著(P0.01)。CDH/TAD的遗传相关和表型相关均为高度负相关。世代内CDH/TAD的遗传相关在(-0.912±0.216)~(-0.671±0.364)间,表型相关在(-0.874±0.005)~(-0.547±0.017)之间,均为负相关且与0有显著性差异(P0.05)。世代间的CDH/TAD的遗传相关系数为-0.874±0.100,表型相关系数为-0.864±0.003,同样均为负相关,且相关系数与0有显著性差异(P0.05)。G_(10)、G_(11)、G_(12)世代内,生长性状(BW、BL)与CDH的遗传相关系数在(-0.986±0.477)~(0.9914±0.7010)之间,表型相关系数在(0.0381±0.0299)~(0.1098±0.0291)之间,均为正表型相关;生长性状(BW、BL)与TAD的遗传相关系数在(-0.374±0.310)~(0.576±0.422)间,表型相关系数在(-0.366±0.324)~(-0.0760±0.0317)间,表现为负表型相关。3个世代间,生长性状(BW、BL)与CDH间的遗传相关系数分别为-0.0945±0.371、-0.123±0.411,均为负遗传相关,表型相关系数分别为0.113±0.0172、0.125±0.0169,均为显著正表型相关(P0.01);生长性状与TAD的遗传相关系数分别为-0.241±0.283、0.703±0.604,表型相关系数分别为-0.118±0.0148、-0.136±0.0146,表现为显著负表型相关(P0.01)。3.基于转录组筛选40日龄中国对虾低温胁迫下的差异表达基因分析低温胁迫组(4℃)和常温组(18℃)中国对虾40日龄幼虾的转录组信息,结果显示:拼接共得到127,939条Unigene,平均长度为1,190 bp。其中35%的Unigene在Nr、Swiss-prot等七大数据库中没有注释。基因差异表达分析共筛选到1,698个差异基因(DEGs),其中920个上调表达,778个下调表达。GO和KEGG富集分析发现DEGs多富集在剪接体、核糖体、胆汁分泌、ABC转运途径以及细胞氮化合物合成过程中。进一步分析共得到8个可能与耐低温性状相关的基因,其中5个上调表达,分别为ATP结合盒蛋白C类(ATP binding cassette protein C3,ABCC3)、酸性神经酰胺酶(Acid ceramidase,ASAH)、谷胱甘肽转移酶(Glutathione Stransferase,GST)、C-型凝集素(C-type lectin)、热休克蛋白HSP70(Heat shock protein HSP70),3个下调表达,分别为假定蛋白:γ-丁基甜菜碱羟化酶(γ-Butyl Betaine Dioxygenase,γ-BBH)、β-氨基己糖苷酶A(β-Hexosaminidase A,β-HEXA)、长链脂肪酸-CoA连接酶(Long chain fatty acid-CoA ligase,ACSBG2)。随机取8个差异基因,通过real time RT-PCR验证表明它们的表达趋势与测序结果一致,证明了RNA-Seq结果的准确性。4.基于转录组筛选凡纳滨对虾低温胁迫下的差异表达基因分析凡纳滨对虾低温胁迫组(18℃)和常温组(24℃)肝胰腺组织的转录组数据。转录组测序共获得50,921条Unigene,平均长度为828 bp,N50为1,589 bp,其中28.13%的Unigene为已知基因。基因差异表达分析共筛选得到243个低温胁迫相关基因,其中89个上调表达,154个下调表达。功能富集分析发现差异表达基因多富集在生物结合和催化过程、过氧化物酶、溶酶体、精氨酸和脯氨酸的代谢以及氨基酸的生物合成途径中。进一步根据Q-value共筛选出10个差异表达最显著的基因,其中ATP结合盒蛋白B类(ATP-binding cassette protein B6,ABCB6)、C型凝集素基因、谷氨酰胺合成酶基因(glutamine synthetase,GS)可能参与了凡纳滨对虾低温应答反应。利用real time RT-PCR验证转录组数据,结果证明基于转录组测序筛选低温胁迫下的差异表达基因是可行的。5.本研究发现ATP结合盒蛋白基因和C型凝集素基因为筛选到的中国对虾和凡纳滨对虾共有的低温候选基因。故推测ATP结合盒蛋白基因和C型凝集素基因可能参与调控对虾响应低温胁迫的分子机制。
【学位单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S917.4
【部分图文】：
上海海洋大学硕士学位论文凡纳滨对虾的转录组数据资源库。杨铭等[57]通过分析凡纳滨对虾的转录组序共挖掘到 14,767 条微卫星序列(Simple sequence repeats, SSR)，且 SSR 在转录出现的频率为 16.76%。Li 等[58]对凡纳滨对虾幼虾进行高通量测序分析，共获109,169 个 Unigenes，其中 37.8%的 Unigenes 在 Nr 数据库中有注释，并经 GOKEGG 等功能注释发现了一些与胚胎发育有关的基因。RNA-seq 较基因芯片(Genechip)等研究转录组的技术，灵敏度更高、数据更准应用更广泛，其测序流程和原理如图 1-1 所示[60]。) ( b )
图 3-1 差异表达基因火山图Fig.3-1 The ‘volcano plot’picture of differential expression genes点表示上调表达基因，绿色圆点表示下调表达基因，蓝色圆点表因dots represent up-regulated genes, green dots represent down regulatedts represent non differentially expressed genes.基因 GO 富集分析运用 GOseq 方法将筛选到的 1,698 个差异基因富集到 30 个 GO-2 所示。差异基因中在生物过程类、细胞成分类和分子功能类中均过程类居多，而生物途径类中，富集差异表达基因最多的三类是成(Cellular nitrogen compound biosynthetic process)、调控氮化合物lation of nitrogen compound metabolic process)、调节含核碱基的化合gulation of nucleobase-containing compound metabolic process)是包含三类；在细胞成分类中，最多的则是核糖体类(Ribosome)；而在分
图 3-2 低温下差异表达基因 GO 富集分析柱状图Fig.3-2 GO enrichment results of different expressed genes under cold challenge3.2.5 差异基因 KEGG 富集分析将差异基因与 KEGG 数据库中的各代谢途径(pathway)作比对，并从中集最显著的前 20 个 pathway 做散点图(图 3-3)。差异表达基因多富集在(Spliceosome)、核糖体(Ribosome)、胆汁分泌(Bile secretion)和 ABC 转运transporters)等途径中。
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本文编号：
2840448
