甜瓜扩展蛋白基因家族成员的鉴定及CmEXPA8和CmEXPA12基因在果实发育中功能的初步分析

发布时间：2020-10-20 10:41

　　 甜瓜(Cucumis melo L.)为葫芦科一年生蔓生草本植物,是一种营养丰富的水果和重要的园艺作物,也是研究果实成熟的理想材料。在植物细胞壁中,扩展蛋白(Expansins)是其重要组成部分之一,通过催化初生壁纤维素与半纤维素之间的非共价键断裂,促使细胞壁组分位移和细胞壁伸展,导致细胞吸水膨大,并且参与pH梯度依赖的细胞壁软化。本研究对扩展蛋白基因在甜瓜果实发育过程中的生物学功能进行初步分析,为甜瓜品质改良提供理论基础,具有重要的科学意义。本研究利用生物信息学方法鉴定甜瓜基因组中35个扩展蛋白基因家族成员。根据MELONMICS数据库中的物理位置信息对扩展蛋白基因家族染色体位置进行分析,结果显示,除了5号染色体上没有该家族基因分布外,该家族基因在各染色体上的分布不均。绘制了甜瓜扩展蛋白基因的外显子-内含子结构图,分析结果表明,除登录号为MELO3C015695T2的基因外,其它家族成员均含有1~4个内含子;对甜瓜、黄瓜和拟南芥的扩展蛋白序列构建系统发育树,可将35个甜瓜扩展蛋白分为四个进化分支:EXPA,EXPB,EXLA,EXLB。通过RT-PCR克隆得到CmEXPA8、CmEXPA12基因的cDNA序列,表达分析表明,CmEXPA8基因在果实发育过程中表达量上调,而CmEXPA12基因随果实成熟度增加表达量降低。构建了这两个基因的超表达载体p PZP-EA8和pPZP-EA12及CRISPR/Cas9基因组编辑载体pCRI-EA8和p CRI-EA12,利用瞬时表达技术侵染甜瓜果实,观察发现注射携带CmEXPA8基因CRISPER/Cas9载体的农杆菌菌液的部位呈现保持绿色的表型;而注射携带CmEXPA12基因超表达载体与CRISPR/Cas9基因组编辑载体的农杆菌菌液的部位均未出现明显表型变化。采用子房注射法,将上述载体分别导入甜瓜获得T_1代转化种子,PCR检测结果表明,转pPZP-EA8、pCRI-EA8、pPZP-EA12和pCRI-EA12载体的阳性率分别为13.3%,16.7%,15%和23.3%。pPZP-EA8与pCRI-EA8转化得到的T_1代甜瓜果实分别呈现提前成熟和推迟成熟的表型,表明CmEXPA8基因在果实成熟过程中具有促进作用,而pCRI-EA12转化得到的T_1代甜瓜果实与同时期授粉的野生型果实相比出现果体变小的表型,表明CmEXPA12基因促进甜瓜果实生长期的膨大生长。
【学位单位】：内蒙古大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S652
【部分图文】：

蛋白基因家族成员的鉴定及 CmEXPA8 和 CmEXPA12 基因在果实发育中功能的。反应条件为：95℃ 预变性 5 min；98℃ 变性 10 s，5 个循环；68℃延伸补平 7 min。产物用 1.0%琼脂糖凝胶电物产物各取 1 μL 作为第二轮 PCR 反应模板，反应体系如下5 μmol/L），4 μL 下游引物（5 μmol/L），10 μL 5×PP （ 2.5 mM each ） ， 2 μL Prime STAR GXL DNA Pl 补足 50 μL。反应条件为: 95℃ 预变性 5 min;；98℃ 变 30 s，30 个循环；68℃延伸补平 7 min。扩增产物用琼脂

甜瓜扩展蛋白基因家族成员的鉴定及 CmEXPA8 和 CmEXPA12 基因在果实发育中功能的初步分析3.2 甜瓜扩展蛋白家族基因结构分析为明确甜瓜扩展蛋白基因家族各基因的外显子与内含子的结构，利用在线 GSDS 软件，根据甜瓜基因组数据库中各基因的 CDS 和 DNA 序列，绘制甜瓜扩展蛋白基因的外显子－内含子结构图（图 3.1）。分析结果表明，除登录号 MELO3C015695T2 的基因外，其他家族成员均含有 1~4 个内含子。

内蒙古大学硕士学位论文3.3 甜瓜扩展蛋白家族的进化分析研究甜瓜扩展蛋白家族成员间的进化关系，利用 MEGA 5.1 软件对甜瓜、拟扩展蛋白序列构建系统发育树。结果表明，35 个甜瓜扩展蛋白可被分为四个XPA，EXPB，EXLA，EXLB，这四个亚家族分别含有 21、3、8 和 3 个扩展蛋被认为是在酸性条件下诱导细胞壁松弛的调节介质 EXPA 亚家族包含基因数目。并根据亚家族分布情况分别命名各亚家族成员（附表）。通过分析 3 个物因家族的进化关系，发现每一个亚家族分支均包含来自三个物种的成员，同时家族基本特征的形成早于这三个物种的分化。
【参考文献】

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本文编号：2848580