致倦库蚊气味受体基因功能研究

发布时间：2017-04-04 08:06

  本文关键词：致倦库蚊气味受体基因功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：致倦库蚊(Culex pipiens quinquefasciatus)广泛分布于全球热带和亚热带地区,也是我国南方地区最常见的蚊种之一,是我国淋巴丝虫病和流行性乙型脑炎的重要传播媒介。致倦库蚊求偶、寻找蜜源、植物汁液及宿主进行吸血,都需要通过嗅觉系统中的气味受体(odorant receptor,OR)结合不同宿主气味化合物,向下游传递嗅觉信号,最终完成对宿主的定位。本研究通过测定不同ORs在致倦库蚊各个生长阶段及不同吸血情况蚊虫头部的表达,结合RNAi技术对ORs功能进行验证；另一方面比较尖音库蚊复合组中致倦库蚊、骚扰库蚊和淡色库蚊(三亚种拥有相似的基因组,形态特征不容易区分,但生理行为方面存在明显的差异。致倦库蚊与淡色库蚊具有兼吸人、兽、鸟等多种宿主血液的复杂嗜血习性,而骚扰库蚊雌蚊不需要吸血也可完成第一次产卵)头部ORs的差异性来推测ORs的功能。从两个方向对致倦库蚊气味受体基因功能进行研究,从而为阻断或者干扰媒介昆虫与宿主之间的信号传导达到防治媒介昆虫的新策略提供理论依据,也可为开发新的驱避剂剂或引诱剂提供依据。主要研究结果如下：1、利用实时荧光定量PCR技术测定11个ORs在致倦库蚊不同生长阶段的表达,结果显示CquiOR117与其它10个ORs相比在致倦库蚊各个生长阶段表达量最高；CquiOR54在卵到蛹以及雄蚊羽化后一周内表达量最低；CquiOR78在雄蚊中特异性表达。同时测定11个ORs在致倦库蚊不同吸血情况头部的表达,结果显示CquiOR15、 CquiOR54、CquiOR71和CquiOR118在雌蚊饱血与未吸血头部之间的表达存在显著性差异,说明这4个ORs可能与致倦库蚊的吸血性有一定的关系。2、利用RNAi技术对CquiOR117进行干扰,结果显示注射CquiOR117dsRNA后1-6天其表达量与对照相比分别下降了19.96%、71.51%、72.99%、70.30%、86.36%、85.41%；结合蚊虫吸血实验发现,注射后1-6天蚊虫饱血率与对照相比分别下降52.30%、45.80%、43.32%、21.45%、4.35%、10.23%,由此可以推测CquiOR117与致倦库蚊的吸血行为有关。3、分别对致倦库蚊、骚扰库蚊和淡色库蚊头部ORs的全长进行克隆,结果得到19个ORs全长序列,通过氨基酸序列比较显示,它们与VectorBase上公布的南非约翰内斯堡株(JHB)雌蚊ORs相比都存在非同义突变,其中最少的CquiOR121有3处,最多的CquiOR11突变位点达到75处。同时对所测定气味受体的跨膜区进行预测,结果显示CquiOR04、CquiOR05、CquiOR06只有骚扰库蚊在其跨膜区出现了突变,而在CquiOR42和CquiOR65跨膜区域却只有骚扰库蚊没出现突变。从另一个方向说明上述5个ORs可能参与了致倦库蚊和淡色库蚊不同于骚扰库蚊的一些生理行为,如致倦与淡色的复杂嗜血性。
【关键词】：尖音库蚊复合组 致倦库蚊 气味受体 荧光定量PCR RNAi
【学位授予单位】：海南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R184.31
【目录】：

• 摘要4-5
• abstract5-10
• 1 文章综述10-14
• 1.1 蚊虫OR研究进展10-12
• 1.1.1 蚊虫嗅觉系统10
• 1.1.2 蚊虫OR特点及特征10
• 1.1.3 不同蚊种OR研究10-12
• 1.2 RNAI技术在蚊虫中研究与应用12-14
• 1.2.1 RNAi背景12
• 1.2.2 RNAi作用分子机制12-13
• 1.2.3 RNAi在蚊虫基因功能研究中的应用13-14
• 2 不同OR在致倦库蚊发育阶段的表达14-29
• 2.1 材料14
• 2.1.1 供试蚊种14
• 2.1.2 主要仪器设备14
• 2.1.3 主要试剂14
• 2.2 方法14-19
• 2.2.1 不同生长阶段蚊虫及蚊虫头部收集14-15
• 2.2.2 不同生长阶段蚊虫及蚊虫头部RNA提取15
• 2.2.3 cDNA获得15-16
• 2.2.4 PCR扩增气味受体(ORs)基因16
• 2.2.5 电泳与测序16
• 2.2.6 PCR产物的纯化16-17
• 2.2.7 LB培养基的配制17-18
• 2.2.8 连接及转化反应18
• 2.2.9 重组质粒的筛选与鉴定18
• 2.2.10 提取重组质粒18
• 2.2.11 目标ORs基因及内参标准曲线的构建18-19
• 2.2.12 不同ORs在致倦库蚊不同生长阶段实时荧光定量PCR分析19
• 2.3 结果19-27
• 2.3.1 气味受体(ORs)基因和内参标准曲线的建立19
• 2.3.2 不同ORs基因在致倦库蚊不同生长阶段的表达分析19-20
• 2.3.3 不同ORs基因在致倦库蚊同一生长阶段的表达比较20-21
• 2.3.4 不同ORs基因在吸血情况不同蚊虫头部的表达分析21-27
• 2.4 讨论与分析27-29
• 3 致倦库蚊CQUIOR117的功能验证29-42
• 3.1 材料29
• 3.1.1 供试蚊种29
• 3.1.2 主要仪器29
• 3.1.3 主要试剂29
• 3.2 方法29-33
• 3.2.1 模板cDNA获得29-30
• 3.2.2 体外合成dsRNA30-31
• 3.2.3 蚊虫的微量注射31-32
• 3.2.4 微量注射dsRNA32
• 3.2.5 注射RNA后CquiOR117表达情况分析32
• 3.2.6 蚊虫嗜血行为实验32-33
• 3.3 结果33-39
• 3.3.1 体外dsRNA合成情况33
• 3.3.2 蚊虫不同麻醉方式效果33-34
• 3.3.3 注射量及部位选择34-35
• 3.3.4 RT-PCR检测注射RNA后蚊虫的干扰率35-36
• 3.3.5 实时荧光定量PCR检测CquiOR117干扰后表达情况36-37
• 3.3.6 蚊虫嗜血行为实验结果分析37-39
• 3.4 讨论与分析39-42
• 4 尖音库蚊复合组中气味受体基因克隆与比较42-70
• 4.1 材料42
• 4.1.1 供试蚊虫42
• 4.1.2 主要仪器42
• 4.1.3 主要试剂42
• 4.2 方法42-44
• 4.2.1 骚扰库蚊、淡色库蚊和致倦库蚊头部RNA的提取42-43
• 4.2.2 骚扰库蚊、淡色库蚊和致倦库蚊头部气味受体基因(ORs)的扩增43
• 4.2.3 PCR产物的回收与纯化43-44
• 4.2.4 连接与转化44
• 4.2.5 重组质粒的筛选与鉴定44
• 4.2.6 尖音库蚊复合组气味受体基因测序结果处理44
• 4.3 结果44-48
• 4.3.1 致倦库蚊、骚扰库蚊和淡色库蚊气味受体基因克隆结果44-45
• 4.3.2 尖音库蚊复合组蚊虫中亚种之间气味受体进化分析45
• 4.3.3 致倦库蚊、骚扰库蚊和淡色库蚊气味受体氨基酸突变位点分析45-47
• 4.3.4 尖音库蚊复合气味受体编码蛋白结构分析47-48
• 4.4 讨论与分析48-70
• 参考文献70-74
• 致谢74

【参考文献】

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  本文关键词：致倦库蚊气味受体基因功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：285180