拟南芥MAT4通过影响表观遗传修饰调控基因沉默的机理研究

发布时间：2020-10-27 23:34

　　 在动植物中' DNA和组蛋白的甲基化修饰能够调节异染色质的形成和转录水平的基因沉默。甲基转移酶在催化甲基化修饰过程中需要S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)提供甲基。因此,维持动植物细胞内正常的SAM水平对表观遗传修饰的调控起着重要的作用,但其调控途径和机理还需更加深入的研究。通过EMS诱变携带Pro35S::NPTⅡ(neomycin phosphotransferaseⅡ)和ProRD29A(responsive to desiccation 29 A)::LUC 的 L119 株系,筛选能够释放 Pro35S::NPTⅡ位点沉默的突变体,得到一个维持基因沉默的作用因子甲硫氨酸腺苷转移酶4(methionine adenosyltransferase 4,MAT4)。本论文对其通过影响表观遗传修饰调控基因表达的机理进行了研究。MAT4能够催化SAM的合成,而SAM是普遍的甲基供体,因此本论文首先对MAT4是否影响甲基化修饰进行分析。通过亚硫酸氢盐测序发现,与L119相比,mat4中CHG和CHH的DNA甲基化水平明显下降。免疫印迹实验证实mat4中组蛋白甲基化修饰H3K9me2的水平显著降低。而进一步的免疫荧光实验发现mat4中H3K9me2在细胞核中异染色质区的状态变得松散。同时染色质免疫共沉淀实验发现mat4中一些位点上H3K9me2的水平下降,这些结果说明MAT4参与维持DNA和组蛋白甲基化修饰过程。转录组测序分析发现mat4中很多转座子的转录被激活,而这些转录发生上调的转座子的DNA甲基化水平下降,说明MAT4通过维持DNA和组蛋白甲基化修饰参与转录水平的基因沉默。另外,外源施加一定浓度的SAM能够部分恢复mat4的卡那霉素敏感表型及H3K9me2的水平,说明SAM是通过直接影响这些甲基化修饰来调节基因转录的。对拟南芥中MAT4所属家族四个成员的研究发现,MAT4对DNA甲基化的影响起主导作用。利用液相色谱和质谱联用技术测定SAM水平,结果显示,与L119相比,mat4中SAM水平下降了35%左右:而其他mat突变体中SAM水平下降程度较小。体外酶活测定发现MAT4的催化能力与MAT1和MAT2相当,而MAT3的活性略高一些,说明MAT4的主导作用并非其活性所致。将MAT4的启动子驱动MAT1、MAT2、MAT3 CDS转入mat4,可互补mat4的表型;而将MAT1、MAT2、MAT3启动子驱动MAT4 CDS转入mat4中,获得的转基因植株大多数不能恢复mat4的抗卡那霉素以及萌发迟缓的表型。进一步用不同MAT启动子的材料检测,发现用MAT4启动子驱动的MAT转录水平以及MAT蛋白水平的丰度最高。因此,MAT4的表达模式可能使其在调控SAM水平上发挥更为重要的作用,进而在影响DNA和组蛋白甲基化修饰过程中起主导作用。遗传分析发现mat1mat4双突变体矮小败育,而mat2mat4双突变体是胚胎致死的。此外,通过CRISPR/Cas9敲除MAT4获得的片段缺失突变体也是致死的,说明MAT4在拟南芥生长和胚胎发育中有重要作用。同时通过体外的Pull-Down实验和体内的Co-IP实验证明不同的MAT蛋白之间能够相互作用,而分子筛实验的结果进一步证明它们在大分子量的复合体中共同存在,说明在拟南芥中这四个MAT蛋白能够形成多聚体发挥功能。综合以上结果,本研究对拟南芥中一个新的维持基因沉默的作用因子MAT4进行了功能研究,揭示了其通过维持植物细胞内SAM浓度,调控DNA和组蛋白甲基化修饰,进而影响一些沉默位点转录的调控机理。这些发现对于阐明植物中代谢过程与表观遗传修饰过程之间的相互联系具有重要的理论意义。
【学位单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：Q943.2
【部分图文】：

精氨酸和天冬氨酸形成ＲＤ界面介导两分子ＤＮＭＴ３Ａ蛋白的互作（图卜１Ａ）。由此形成两个活性??位点，这两个活性位点被８－１０ｂｐ的一个ＤＮＡ螺旋分开，ＤＮＭＴ３Ａ催化ＤＮＡ甲基化的建立，产生??相隔８－１０?ｂｐ的两个甲基化的ＣＧ位点（图１－１Ｃ）?（Ｊｅｌｔｓｃｈ?ａｎｄ?Ｊｕｒｋｏｗｓｋａ＾?２０１３，?２０１６）。研宄表明??ＤＮＭＴ３Ａ具有寡聚化和多聚化的潜能：即在同一条ＤＮＡ链上可以结合上多个相邻的??ＤＮＭＴ３Ａ－ＤＮＭＴ３Ｌ四聚体，因此可以看到在同一条ＤＮＡ链上存在相同间隔的ＣＧ甲基化修饰。??ＤＮＡ结合实验及扫描电镜也发现ＤＮＭＴ３Ａ－ＤＮＭＴ３Ｌ形成的多聚体可以结合多条ＤＮＡ链，从而??催化?ＤＮＡ?甲基化的建立（图?１－１Ｂ，１Ｃ，?ＩＤ，?ＩＥ）?（Ｊｅｌｔｓｃｈ?ａｎｄ?Ｊｕｒｋｏｗｓｋａ，?２０１３，?２０１６）。另外?ＤＮＭＴ３Ａ??的催化活性受到自身及未发生甲基化的Ｈ３Ｋ４残基调节。晶体结构解析发现ＤＮＭＴ３Ａ的ＡＤＤ结??构域能够与自身的ＣＤ结构域（ｃａｔａｌｙｔｉｃ?ｄｏｍａｉｎ）结合，从而通过阻碍其与ＤＮＡ的结合抑制ＣＤ??结构域的催化活性。而未发生甲基化的组蛋白Ｈ３则能够破坏ＡＤＤ－ＣＤ的结合，解除ＤＮＭＴ３Ａ??的自我抑制作用（Ｇｕｏ?ｅｔａｌ．

精氨酸和天冬氨酸形成ＲＤ界面介导两分子ＤＮＭＴ３Ａ蛋白的互作（图卜１Ａ）。由此形成两个活性??位点，这两个活性位点被８－１０ｂｐ的一个ＤＮＡ螺旋分开，ＤＮＭＴ３Ａ催化ＤＮＡ甲基化的建立，产生??相隔８－１０?ｂｐ的两个甲基化的ＣＧ位点（图１－１Ｃ）?（Ｊｅｌｔｓｃｈ?ａｎｄ?Ｊｕｒｋｏｗｓｋａ＾?２０１３，?２０１６）。研宄表明??ＤＮＭＴ３Ａ具有寡聚化和多聚化的潜能：即在同一条ＤＮＡ链上可以结合上多个相邻的??ＤＮＭＴ３Ａ－ＤＮＭＴ３Ｌ四聚体，因此可以看到在同一条ＤＮＡ链上存在相同间隔的ＣＧ甲基化修饰。??ＤＮＡ结合实验及扫描电镜也发现ＤＮＭＴ３Ａ－ＤＮＭＴ３Ｌ形成的多聚体可以结合多条ＤＮＡ链，从而??催化?ＤＮＡ?甲基化的建立（图?１－１Ｂ，１Ｃ，?ＩＤ，?ＩＥ）?（Ｊｅｌｔｓｃｈ?ａｎｄ?Ｊｕｒｋｏｗｓｋａ，?２０１３，?２０１６）。另外?ＤＮＭＴ３Ａ??的催化活性受到自身及未发生甲基化的Ｈ３Ｋ４残基调节。晶体结构解析发现ＤＮＭＴ３Ａ的ＡＤＤ结??构域能够与自身的ＣＤ结构域（ｃａｔａｌｙｔｉｃ?ｄｏｍａｉｎ）结合，从而通过阻碍其与ＤＮＡ的结合抑制ＣＤ??结构域的催化活性。而未发生甲基化的组蛋白Ｈ３则能够破坏ＡＤＤ－ＣＤ的结合，解除ＤＮＭＴ３Ａ??的自我抑制作用（Ｇｕｏ?ｅｔａｌ．

甲基化的过程主要为：ＵＨＲＦ１的同源蛋白ＶＩＭ１／２／３?（Ｖａｒｉａｎｔ?Ｉｎ?Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ?１／２／３）通过其ＳＲＡ结??构域识别半甲基化的ＤＭＡ，ＭＥＴ１通过与Ｖ１Ｍ１／２／３相互作用从而被招募至靶位点，催化新合成的??ＤＮＡ链上的甲基化：完成ＤＮＡ甲基化的维持过程（图１－４Ｃ）?（Ｋｉｍ?ｅｔ?ａＬ，?２０１４；?Ｗｅｎｄｔｅ?ａｎｄ?Ｓｃｈｍｉｔｚ，??２０１８；?Ｗｏｏ?ｅｔ?ａｌ．，２００８）。研宄发现ＶＩＭ蛋白在维持ＤＮＡ甲基化的过程中存在功能冗余，Ｗｗｉ、ｗ＇ｗ２??或咖＾单突变体中ＤＮＡ甲基化水平并无显著变化，但是ｖ／ｗ２?ｖ／ｗＪ三突变体中ＣＧ甲基化??水平非常低（Ｓｔｒｏｕｄ?ｅｔ?ａｌ．，?２０１３）。另外有研宄发现有些位点上ＣＧ甲基化的维持需要去乙酰化酶??ＨＤＡ６?（ｈｉｓｔｏｎｅ?ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ?６）的参与，它能够与ＭＥＴ１相互作用从而辅助该类位点进行ＣＧ甲基化??的维持（Ｂｌｅｖｉｎｓ?ｅｔａｌ．，?２０１４；?Ｗｅｎｄｔｅ?ａｎｄ?Ｓｃｈｍｉｔｚ，?２０１８）。ＤＮＡ甲基化的维持需要染色质重塑因子??ＤＤＭｌ（Ｄｅｃｒｅａｓｅｉｒ＾ＤＮＡＭｅｔｈｙ丨ａｔｉｏｎｌ）的参与，ｃＷｗＪ中定位于异染色质区的一些转座子的ＣＧ甲??基化水平下降非常明显，因此ＤＤＭ１可能主要调控异染色质区的染色质环境从而利于ＤＮＡ甲基??转移酶ＭＥＴ１催化异染色质区一些转座子位点上ＣＧ的甲基化（Ｊｅｄｄｅｌｏｈ?ｅｔ?ａｌ．
【参考文献】

相关期刊论文 前2条

1 Hsuan Yu Kuo;Elise L.Jacobsen;Yanping Long;Xinyuan Chen;Jixian Zhai;;Characteristics and processing of Pol Ⅳ-dependent transcripts in Arabidopsis[J];Journal of Genetics and Genomics;2017年01期

2 Natalia A Osna;Wayne G Carter;Murali Ganesan;Irina A Kirpich;Craig J Mc Clain;Dennis R Petersen;Colin T Shearn;Maria L Tomasi;Kusum K Kharbanda;;Aberrant post-translational protein modifications in the pathogenesis of alcohol-induced liver injury[J];World Journal of Gastroenterology;2016年27期

本文编号：2859236