水曲柳体胚发生相关SERK基因克隆和表达分析

发布时间：2020-11-03 04:49

　　 水曲柳(Fraxinus mandshurica Rupr.)为木犀科梣树属的落叶乔木,是我国东北地区珍贵的阔叶树种。水曲柳不仅具有较高的经济价值,还有重要的生态价值。近几年,课题组对水曲柳组织培养及体胚发生等方面进行了细致的研究,但在体胚诱导研究过程中发现大量的畸形胚,大量研究表明,在参与诱导体细胞胚胎发生的基因中,蛋白激酶类是生物生命活动中极其重要的一类蛋白,其中SERK基因作为体细胞胚胎发生过程中胚性细胞的一种标记,标记胚性细胞的形成到胚胎发生这一过程。同时,SERK基因有可能大范围的参与了除植物生长发育外的其它生物学过程。为深入了解水曲柳体细胞胚胎发生机理,本研究以水曲柳成熟胚和未成熟胚为外植体诱导体细胞胚及愈伤组织,采用同源克隆法对体细胞胚发生相关的SERK基因进行分离克隆,获得cDNA全长,并利用荧光定量PCR技术对水曲柳不同器官、组织及不同发育时期的体细胞胚进行表达分析,以期为水曲柳体胚发生机理的研究奠定基础。通过研究结果如下:1.分别以水曲柳未成熟胚和成熟胚为外植体,在MS1/2培养基中分别附加NAA(3.0mg/L,5.0 mg/L)、6-BA(1.5 mg/L,2.0 mg/L)、水解酪蛋白(CH)400 mg/L、蔗糖75 g/L、琼脂6 g/L,获得了体细胞胚,为后续研究提供了试验材料。2.利用同源克隆法从水曲柳基因组DNA中分离获得目的基因SERK片段,测序分析片段长为920 bp,含有2个内含子,通过NCBI数据库Blast分析比对该SERK基因片段与其他物种的SERK基因具有较高的同源性。3.采用RACE技术,成功的从水曲柳基因组中获得SERK基因的cDNA全长序列,测序结果表明cDNA全长为2580 bp,该序列的编码区(CDS)长度为1884 bp,编码627 a,5’端和3’端分别有122 bp和599 bp的非翻译区,获得的SERK基因的CDS长度与拟南芥(Arabidopsis thaliana(L.)Heynh.)、烟草(Nicotiana tabacum L.)等模式植物的SERK同源基因核苷酸序列的同源性均在80%以上。表明已从水曲柳基因组中克隆获得SERK基因全长,将该基因命名为FmSERK(GeneBank登录号:KT071544)。4.利用DNAMAN软件和DNAClub等生物信息学软件对FmSERK基因的蛋白结构进行聚类分析,结果表明FmSERK基因编码的氨基酸序列与其他物种的氨基酸序列比对同源性均在89%以上,表明水曲柳体胚发生相关FmSERK基因在进化上属于SERK同源基因中的SERK/LRR-RLK类基因家族;该基因共编码627个氨基酸;其蛋白分子量是69.3916 KDa,理论推导半衰期为30h,不稳定参数是39.06,说明该蛋白为不稳定蛋白;理论等电点5.57,脂肪族氨基酸指数:96.56。对FmSERK氨基酸组成及理化性质分析得出该氨基酸组成中有亮氨酸Leu(L)含量最多,为13.9%;Gly(G)和Pro(P)次之,为7.2%、7.0%;没有检测到吡咯赖氨酸Pyl(O)和半胱氨酸Sec(U)。该蛋白带负电荷残基总数(Asp+Glu)数为74个,其中带正电荷残基(Arg+Lys)总数为61个。总的亲水性平均系数为-0.148,预测该蛋白属于亲水性蛋白。5.利用实时荧光定量PCR技术检测SERK基因在水曲柳不同器官、组织中的表达情况,结果显示,该基因在不同器官和组织中均有表达,但在胚性愈伤组织中的表达量最高,非胚性愈伤组织中表达量最低,甚至不表达;通过对水曲柳体胚发育不同时期SERK基因的表达量进行分析得出:SERK基因在球形胚时期的表达量最低,随着体胚的发育,心形胚、鱼雷胚阶段表达量逐渐升高,到子叶胚时期SERK基因的表达量达到最高,成熟胚时期SERK基因的表达量逐渐下降;通过对水曲柳体胚诱导不同时间的定量分析结果表明:培养初期0 d-15 d时,细胞在外源激素的刺激下开始启动进行脱分化,FmSERK基因的表达量处于平稳表达阶段。随着诱导时间的增加,在培养20 d-30 d时SERK基因的表达量逐渐增加,当诱导培养35 d时FmSERK基因的表达量达到最高,然后FmSERK基因的表达量开始下降,说明FmSERK基因对水曲柳体胚不同培养阶段细胞的表达具有调控作用,是体胚发生相关的标记基因。
【学位单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S792.41
【部分图文】：

1.2 体胚发生相关 SERK 基因克隆及其功能的研究1.2.1SERK 基因SERK（Somatic Embryogenesis Receptor-like Kinases）基因，全称为 体细胞胚胎发生相关类受体蛋白激酶基因 ，是重要的体胚发生相关基因（Becraft，1998）。该基因属于植物受体类蛋白激酶家族中较大的家族――富亮氨酸重复序列受体类蛋白激酶LRR-RLK 亚家族（Zhang et al，1998）。目前，关于 SERK 基因的序列注册 NCBI 已接受几十余种，这些基因加在一起组成了一个家族，就是 SERK 基因家族(Schmidt ED，1997)。SERK 基因广泛的存在于植物体内，在不同物种中表达方式不同，多数 SERK 基因参与了体胚的发生（Thomas，2004；Somleva，2006）。SERK 基因的表达和体细胞胚胎发生关系密切，与孤雌生殖紧密相连。关于 SERK 基因的发现最初是在胡萝卜下胚轴经过悬浮培养获得的胚性细胞中分离出来的，即 DcSERK。对于 SERK 基因结构研究最清楚和最彻底的是 AtSERK1 基因（甄睿，2011）。SERK 基因的构成是由 11 个外显子和 10 个内含子（如图 1-1 所示），具有相似的内含子/外显子结构特征，同时外显子与编码蛋白功能域基本上是一一对应（Emidio，2005）。

图 2-1 合子胚的三种不同外植体（孔冬梅，200Fig.2-1 Three different explant of zygote (kong dongmeA 下胚轴；B 不完整胚；C 子叶A Hypocotyl; B Incomplete embryos; C Cotyledo用 MS1/2 培养基。激素组合分别为：6-BA2.0 mg/L+NAA5 mg/L添加水解酪蛋白（CH）400 mg/L、75 g/L 蔗胚轴接种到培养基上，每个处理接种 10 皿养初期每天观察和统计外植体的污染情况立刻将未污染的外植体在无菌条件下转移到行统计。继代培养采用的培养基与初代培养养的污染不算入外植体污染率统计当中。在密封不透光纸盒箱中，再放入培养室中

3+6-BA1.5 未成熟合子胚胚轴 17.4 11.55+6-BA2 未成熟合子胚子叶 7.1 12.33+6-BA1.5 未成熟合子胚子叶 11.5 15.95+6-BA2 成熟合子胚胚轴 12.7 11.33+6-BA1.5 成熟合子胚胚轴 12.4 9.75+6-BA2 成熟合子胚子叶 14.3 12.13+6-BA1.5 成熟合子胚子叶 13.5 11.8本实验设计两种激素组合分别对水曲柳成熟胚和未成熟胚进行诱导，在对为成熟体胚诱导的试验中，愈伤组织诱导率最高为 17.4%，是使用 NAA3 mg/L+6-BA1/L 激素组合对胚轴进行诱导，体胚诱导率最高为 15.9%，同样是使用 NAA/L+6-BA1.5 mg/L 的激素组合进行诱导，说明该激素组合适合未成熟胚的愈伤组织体胚诱导；在对成熟胚进行诱导的试验中，愈伤组织诱导率和体胚诱导率最高的合都为 NAA5 mg/L+6-BA2 mg/L，说明该激素组合适合成熟胚的愈伤组织诱导和导。在诱导过程中会诱导产生颜色呈黄色或半透明颗粒状（图 2-1）的愈伤组织还伴随着与愈伤组织相似的组织，但该组织呈黄褐色且质感较硬，为非胚性愈伤图 2-2），在继代培养中，逐渐褐化死亡。
【参考文献】

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本文编号：2868115