第一部分重组慢病毒介导的MCM7基因沉默对白血病K562细胞生物学效应的影响及其机制的研究目的:鉴于特异性抑制MCM7基因表达能够抑制白血病的发生发展,研究抑制微小染色体维持蛋白7 (minichromosome maintenance protein, MCM7)后相关基因表达的变化,为进一步了解白血病的发生机制和将MCM7引入白血病的基因靶向治疗提供实验理论依据。方法:1、Easy-siRNA设计:通过Genebank找到MCM7mRNA序列,设计3条针对MCM7编码区的siRNA靶序列,并经Blast确定序列特异性,在序列两端加相应的限制性内切酶切位点。2、目的慢病毒载体的构建:3种带有绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)筛选标记的MCM7基因沉默重组慢病毒颗粒LV-MCM7-RNAi(23977-1),LV-MCM7-RNAi(23978-1),LV-MCM7-RNAi(23979-1)及阴性对照重组病毒 LV-NC-RNAi,构建 MCM7 特异性shRNA重组病毒。3、3种MCM7特异性shRNA重组病毒分别转染K562细胞株,荧光显微镜下观察转染效率。Real-time PCR分别检测MCM7转录水平,筛选出靶点敲减效率最高的一种重组慢病毒颗粒。4、通过Real-time PCR及Western blot检测转染前后对MCM7转录及蛋白的表达的抑制情况。5、按照重组病毒干预与否,分为LV-MCM7-RNAi组、LV-NC-RNAi对照组和空白对照组。体外通过应用FCM检测K562细胞周期及凋亡情况。体外探讨特异性抑制MCM7的表达对K562细胞的生物学特性的影响。6、采用Real-time PCR及Western blot法进行验证,找寻起关键作用的信号途径,初步阐明MCM7在白血病的作用和分子机制。7、建立白血病移植瘤的动物模型:BALB/C裸鼠随机分为3组,建立局部移植瘤模型。每天观察裸鼠背部移植瘤的成瘤和生长情况,绘肿瘤生长曲线,每4天记录一次。8、肿瘤病理组织学检查:取各组裸鼠的肿瘤组织Real-time PCR和Western blot检测肿瘤标本内MCM7基因转录及蛋白的表达。同时制作病理切片进行免疫组化染色。结果:荧光显微镜显示重组病毒对目的细胞的感染效率90%, Real-time PCR及Western blot显示LV-MCM7-RNAi组与LV-NC-RNAi组和空白对照组相比,MCM7基因转录和蛋白的表达均显著下调,靶点敲减效率分别达(92.3±1.88) %和(91.18±0.93) %。CCK8结果显示:自第24h起,稳转株细胞的增殖与两组对照细胞相比明显受抑制。FCM结果显示LV-MCM7-RNAi组较LV-NC-RNAi组和空白对照组G0/G1期细胞比例明显增加,而S期显著减少,M期也有小幅度减少,细胞周期被阻滞在G1期。FCM凋亡检测LV-MCM7-RNAi组细胞凋亡率为(45.12±1.68)%,明显高于 LV-MCM7-RNAi 组(7.96士0.85)%和空白对照组(8.37±1.02)%。Western blot 显示 LV-MCM7-RNAi 组的 Polo-Like 激酶 1 ( PLK1)及磷酸化的PLK1(p-PLK1)均较LV-NC-RNAi组和空白对照组表达明显下调,而P73、bax基因表达上调。实验动物模型生长曲线表明LV-shRNA-MCM7重组病毒组裸鼠的肿瘤生长明显慢于LV-shRNA-negative对照组和空白对照组。结论:MCM7基因沉默使肿瘤细胞被阻滞在G1期,DNA无法复制,增殖受抑制。因周期阻滞作用,PLK1基因无法激活,PLK1及pPLK1蛋白表达下调,从而使其对抑癌基因p73基因转活性的抑制作用降低,p73基因及其下游基因bax表达上调,导致肿瘤细胞凋亡增加。第二部分重组慢病毒介导的MCM7基因沉默对肝癌MHCC-97H细胞生物学效应的影响目的:本研究探讨应用慢病毒介导的RNAi技术特异性沉默MCM7基因对肝癌细胞MHCC-97H生物学效应的影响。方法:以人MCM7编码序列作为干扰靶点,构建靶向MCM7的shRNA慢病毒载体,转染肝癌细胞MHCC-97H,建立稳定转染细胞株。按照重组病毒干预与否,分为LV-MCM7-RNAi组、LV-NC-RNAi对照组和空白对照组。应用实时定量PCR及Western blot检测各组肝癌细胞MCM7表达的变化。MTT检测细胞增殖情况,流式细胞技术检测细胞周期及细胞凋亡,划痕法检测迁移能力改变,Transwell侵袭小室实验以穿膜细胞的数量评估各组肝癌细胞的侵袭能力。结果:荧光显微镜显示重组病毒对目的细胞的感染效率90%, Real-time PCR及Western blot结果显示LV-MCM7-RNAi组MCM7 mRNA及蛋白的表达水平较阴性对照组(LV-NC-RNAi)及空白对照组显著降低(P0.05)。MTT结果显示LV-MCM7-RNAi组细胞增殖速度显著抑制(P0.01)。流式细胞仪检测细胞周期显示LV-MCM7-RNAi组较LV-NC-RNAi组和空白对照组G0/G1期细胞比例明显增加,而S期显著减少,细胞周期被阻滞在G1期。同时LV-MCM7-RNAi组的细胞凋亡率显著增加。在MCM7基因有效沉默后,肝癌细胞MHCC-97H的侵袭及迁移能力显著下降(P0.05)。结论:慢病毒介导的shRNA能有效沉默肝癌MHCC-97H细胞MCM7基因的表达,肿瘤细胞的细胞周期被阻滞于GO/G1期,并能诱导肿瘤细胞凋亡。同时,MCM7基因沉默可抑制肝癌MHCC-97H细胞的体外增殖、侵袭等生物学效应。
【学位单位】：东南大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2017
【中图分类】：R733.7
【部分图文】：
?ｌｉｃｅｎｓｉｎｇ??Ｌ＾＾ｔｏｃｈｒｏｍａｔｉｎ?＾ｉｎａｃｔｉｖｅ?＾??图１－１：?ＭＣＭ在细胞周期中的调控作用［７７］??■ｉｌｌｌｉｆ?Ｐ—??＾?ＭＣＨ７?ｇｅｎｏｍｅ?＃??／?人?？??＊?ｍｉＲ１０６ｂ－２５?ｐ２ｌ?ｍＲＮＡ??，Ｕ?＾?；？?＾??多：？：?４?＞？??ＩＩ？?？?Ｊ?Ｐ??＾?？?＾??ｚ?＿?一??＾?＾ｇｉ??图１－２：?ＭＣＭ７致癌信号通路图［７８］??９??
图１－１：?ＭＣＭ在细胞周期中的调控作用［７７］??Ｐ—??
图１－３ｓｈＲＮＡ作用过程??１．２．２设计原则：??１．２．２．１克隆到ｓｈＲＮＡ表达载体中的ｓｈＲＮＡ包括两个短反向重复序列，中间由？？莲环（ｌｏｏｐ）??序列分隔的，组成发夹结构，由ｐｏｌＩＩＩ启动子控制。随后在连上５－６个Ｔ作为ＲＮＡ聚合酶ＩＩＩ??的转录终止子。??１．２．２．２两个互补的寡核苷酸两端须带有限制性酶切位点。??１．２．２．３?ＳｔｒａｔａＧＥＮＥ发现２９个寡核苷酸较之原先推荐的２３个寡核苷酸可以更有效的抑制丨丨??的基因。??１．２．２．４在启动子下游的酶切位点下方紧连一个Ｃ，使插入片段和启动子有一定空间间隔以确??保转录的发生。??１．２．２．５?ｓｈＲＮＡ目的序列的第？个碱基必须是Ｇ以确保ＲＮＡ聚合酶转录。如果选择的目的序??，一。??
【参考文献】
相关期刊论文 前10条
1 Alexander Schlachterman;Willie W Craft Jr;Eric Hilgenfeldt;Avir Mitra;Roniel Cabrera;;Current and future treatments for hepatocellular carcinoma[J];World Journal of Gastroenterology;2015年28期
2 Wei Guo;Wangbing Chen;Wendan Yu;Wenlin Huang;Wuguo Deng;;Small interfering RNA-based molecular therapy of cancers[J];Chinese Journal of Cancer;2013年09期
3 Stefanie A Knoepfel;Mireille Centlivre;Ying Poi Liu;Fatima Boutimah;Ben Berkhout;;Selection of RNAi-based inhibitors for anti-HIV gene therapy[J];World Journal of Virology;2012年03期
4 李墨;吴非;张恒;韩艳玲;刘俊;陈小龙;韩昱晨;;RACK1通过影响MCM7磷酸化促进肺癌细胞的增殖[J];肿瘤;2012年03期
5 Kamlesh Sodani;Atish Patel;Rishil J.Kathawala;;Multidrug resistance associated proteins in multidrug resistance[J];癌症;2012年02期
6 刘娟;殷飞;姚树坤;;细胞周期素D1、视网膜母细胞瘤样蛋白2及微小染色体维持蛋白7在肝细胞癌中的表达及对预后的意义[J];中国病理生理杂志;2011年02期
7 ;Cytokinesis and cancer:Polo loves ROCK'n' Rho(A)[J];遗传学报;2010年03期
8 任占平;石喆;杜娟;陈蔚麟;唐德艳;戴文斌;;乳腺癌组织中HPV16 18E6及p53 MCM7蛋白的表达及意义[J];中国肿瘤临床;2008年06期
9 熊福银;刘慧远;陈红星;邓继先;;丝/苏氨酸蛋白激酶Plk1研究进展[J];中国生物工程杂志;2007年05期
10 王立辉;杨静玉;吴春福;;胃癌信号转导通路治疗靶点的研究进展[J];中国药理学通报;2007年02期
本文编号：
2869765
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/jiyingongcheng/2869765.html
