中国甜柿自然脱涩相关基因ALDH2的功能分析

发布时间：2020-11-11 16:38

　　 中国甜柿自然脱涩性状受显性单基因控制,因而在完全甜柿遗传改良中具有重大的应用价值,但其自然脱涩关键基因及其调控网络尚不完全明确。已知中国甜柿自然脱涩过程与乙醛介导的“凝固效应”(即可溶性单宁向不溶性单宁的转化过程)有关,但乙醛代谢下游的关键基因ALDH2(醛脱氢酶2基因家族)在其中的功能特性尚不清楚。本研究以中国甜柿(‘鄂柿1号’和‘罗田甜柿’),日本甜柿(‘阳丰’)和非完全甜柿(‘磨盘柿’)为试材,首先基于转录组数据库中ALDH2基因相关差异表达片段,从‘鄂柿1号’(Diospyros kaki Thunb.‘Eshi 1’)中分离获得了ALDH2基因家族成员的cDNA全长,分析其表达模式并利用柿叶片瞬时表达技术体系对ALDH2基因进行功能验证;进而,应用酵母单杂交系统筛选与ALDH2基因互作的转录因子,进一步明确中国甜柿自然脱涩的分子调控网络;最后,结合转录组测序技术和柿瞬时转化体系,分析ALDH2及部分单宁代谢关键基因在中国甜柿叶片中瞬时超表达后的差异表达基因,进一步挖掘与中国甜柿自然脱涩直接相关的候选基因,以期为中国甜柿自然脱涩分子机理的解析及其遗传改良提供科学依据。主要研究结果如下:1.基于转录组数据库中的序列信息,通过cDNA末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)技术获得ALDH2基因家族两个成员——DkALDH2a和DkALDH2b,其cDNA序列全长分别为1,984 bp和1,933 bp,分别编码542和540个氨基酸。DkALDH2a和DkALDH2b在中国甜柿叶片中瞬时超表达后,叶片可溶性单宁和不溶性单宁含量均显著升高;瞬时干涉表达后,叶片中可溶性单宁含量前者无明显变化,后者显著降低。二者均可通过减少可溶性单宁的消耗进而抑制脱涩。2.DkALDH2a主要作用于种子器官,其表达量在果实发育过程中逐渐降低,以致大量乙醛从种子扩散到果肉中,进而通过凝固效应促进脱涩。DkALDH2b主要是直接在果肉中大量表达,这可能是由于果肉中底物乙醛的积累所致,但其消耗的乙醛不足以阻止中国甜柿自然脱涩。因此,DkALDH2a和DkALDH2b的表达量与中国甜柿自然脱涩呈负相关关系。3.基于DkALDH2a和DkALDH2b全长序列信息,通过染色体步移技术分别分离到515 bp和1,209 bp启动子序列。以DkALDH2b启动子构建pALDH2b-AbAi诱饵载体并转化Y1HGold酵母菌株,应用酵母单杂交技术从酵母文库中筛选到16个阳性克隆,经序列分析后新发现1个与ALDH2b互作的BBR/BPC1转录因子。4.结合转录组测序技术和柿瞬时转化体系,筛选ALDH2及单宁代谢关键基因LAC1和ANR在中国甜柿叶片中瞬时超表达后的特异表达基因,共得到119.63 Gb Clean Data。通过Trinity软件从头拼接(de novo assembly),共得到192,597个转录本、100,371条Unigene。其中56,009条Unigene(约55.8%)获得了功能注释信息。注释为ERF家族的转录因子基因数目最高,且在三种处理中上调表达,说明其可能参与中国甜柿自然脱涩的调控过程。综上所述,本研究明确了ALDH2基因家族的两个成员——DkALDH2a和DkALDH2b与中国甜柿自然脱涩之间的关系,并发现可能调控中国甜柿自然脱涩的两类转录因子BBR/BPC1和ERF。该结果为中国甜柿自然脱涩分子机理的解析及其遗传改良提供了参考。
【学位单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S665.2
【部分图文】：

6图 1-1 柿单宁的生物合成途径[根据 Akagi 等（2011）有修改]DAHPS：3-脱氧-D-阿拉伯糖型-庚酮糖酸-7-磷酸合成酶；DHQS：3-脱氢奎尼酸合成酶；DHD/SDH：3-脱氢奎尼酸脱氢酶/莽草酸-5-脱氢酶；SK：莽草酸激酶；EPSPS：5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶；CS：分支酸合酶；PAL：苯丙氨酸解氨酶；C4H：肉桂酸-4-羟化酶；4CL：4-香豆酸辅酶 A 连接酶；CHS：查尔酮合酶；CHI：查尔酮异构酶；F3H：黄烷酮-3-羟化酶；F3′H：类黄酮 3′-羟化酶；F3′5′H：类黄酮 3′5′-羟化酶；DFR：二氢黄酮醇-4-还原酶；ANS：花青素合酶；LAR：无色花青素还原酶；ANR：花青素还原酶；GT：糖基转移酶；OMT：O-甲基转移酶；GST：谷胱甘肽 S-转移酶；MATE transporter：多药物和有毒化合物排出转运蛋白；CE：缩合酶。Fig. 1-1 The biosynthesis pathway of persimmon proanthocyanidinModified from Akagi et al.（2011）DAHPS: 3-deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate synthase; DHQS: 3-dehydroquinate synthase;DHD/SDH: 3-dehydroquinate dehydratase/shikimate 5-dehydrogenase; SK: shikimate kinase; EPSPS:5-enolpyruvylshikimate 3-phosphte synthase; CS: chorismate synthase; PAL: phenylalanineammonia-lyase; C4H: cinnamate-4-hydroxylase; 4CL: 4-coumarate:CoA ligase; CHS: chalconesynthase; CHI: chalcone isomerase; F3H: flavanone 3-hydroxylase; F3′H: flavonoid 3′-hydroxylase;F3′5′H: flavonoid 3′5′-hydroxylase; DFR: dihydroflavonol 4-reductase; ANS: anthocyanidin synthase;LAR: leucoanthocyanidinreductase; ANR: anthocyanidin reductase; GT: glycosyltransferase; OMT:O-methyltransferase; GST: glutathione S-transferase; MATE transpo

kaki Thunb‘.Youhou’）和非完全甜柿‘磨盘柿’（D. kaki Thunb‘.Mopanshi’）2.5 WAB（花后数周）、5 WAB、10 WAB、15 WAB、20 WAB 和 25 WAB 的果实（图2-1）。部分试材采用本课题组 Mo 等的研究材料（Mo et al. 2016）。取果实赤道部果肉，液氮速冻后于-80℃冰箱保存。三个品种盛花期的花、茎、叶以及 20 WAB 的萼片、果皮、果心和种子，每一份样品进行 3 次生物学重复，每一个重复包括 10 个果实。

3 结果与分析3.1 不同脱涩类型柿果发育过程中单宁含量变化比较不同脱涩类型柿果中可溶性单宁百分含量随着果实的发育均呈持续下降趋势。‘罗田甜柿’果实在 25 WAB 时，可溶性单宁百分含量已降为 0.6%，此时已十分接近脱涩；‘阳丰’果实中可溶性单宁百分含量在发育前期便迅速下降，到 15 WAB时已经降至“涩感”临界含量 0.1%以下，并一直保持极低水平，此时已完全脱涩，与先前人研究结果一致（Ikegami et al. 2005，Akagi et al. 2009）。‘磨盘柿’果实可溶性单宁百分含量一直要高于‘罗田甜柿’和‘阳丰’，直到 25 WAB 仍高于 1.0%，且有很强的涩感（图 2-2a）。三类品种不溶性单宁的百分含量亦呈现下降趋势，但与日本甜柿‘阳丰’和非完全甜柿‘磨盘柿’不同的是，中国甜柿‘罗田甜柿’果实发育 10-25 WAB 不溶性单宁含量呈现先上升后下降的变化过程（图 2-2b）。
【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 黄金盟;江一红;全金成;;广西甜柿发展前景分析[J];南方园艺;2017年06期

2 焦进良;;提高甜柿栽植成活率的技术措施[J];果农之友;2018年04期

3 陈世平;;福建·仙游台湾甜柿产业欣欣向荣[J];中国果业信息;2013年12期

4 柏斌;;云南·石林将打造全国甜柿种植大县[J];中国果业信息;2014年07期

5 田永强;;我国甜柿产业的发展现状、对策与前景[J];中国果业信息;2015年02期

6 陈世平;;福建·仙游地产台湾甜柿销售顺畅[J];中国果业信息;2015年12期

7 陈世平;;福建·仙游台湾甜柿价格下滑[J];中国果业信息;2016年11期

8 陈世平;;福建·建瓯台湾甜柿销售顺畅[J];中国果业信息;2016年12期

9 高敏;;甜柿偶开雄花现象及杂交后代早期鉴定[J];中国果业信息;2017年04期

10 陈世平;;福建·甜柿栽培技术规范省级地方标准正式实施[J];中国果业信息;2017年05期

相关博士学位论文 前9条

1 徐君驰;中国甜柿自然脱涩相关基因ALDH2的功能分析[D];华中农业大学;2018年

2 张青林;完全甜柿及部分雄性种质间的亲缘关系研究[D];华中农业大学;2006年

3 胡德昌;柿及其部分近缘种mtDNA和cpDNA多态性分析[D];华中农业大学;2007年

4 裴忺;中国甜柿自然脱涩性状早期筛选及其杂交育种研究[D];华中农业大学;2013年

5 王燕;中国原产完全甜柿自然脱涩机理研究[D];华中农业大学;2010年

6 关长飞;中国甜柿cDNA-SSAP文库构建及自然脱涩相关基因功能验证[D];华中农业大学;2016年

7 莫荣利;中国甜柿自然脱涩相关基因ADH和PDC的分离及功能验证[D];华中农业大学;2015年

8 唐仙英;柿无核或少核机理及无核类型培育研究[D];华中农业大学;2001年

9 魏平;柿砧木耐盐抗旱及嫁接亲和性研究[D];西北农林科技大学;2017年

相关硕士学位论文 前10条

1 吴晨阳;甜柿品种‘太秋’适宜砧木的筛选及利用研究[D];扬州大学;2018年

2 李佳颖;草酸与1-甲基环丙烯处理对‘阳丰’甜柿采后冷害的控制作用[D];西北农林科技大学;2018年

3 李锐;甜柿储运病害与调控技术研究[D];天津科技大学;2009年

4 徐洪蕊;基于计算机视觉对“次郎”甜柿外部品质检测与分级的研究[D];南京农业大学;2010年

5 李文杰;仙游县甜柿产业发展研究[D];福建农林大学;2011年

6 刘同祥;保山甜柿园主要矿质营养与产量品质的关系及适宜值分析[D];中国林业科学研究院;2017年

7 张娜;中国甜柿新种质创制及其经济性状评价初探[D];华中农业大学;2017年

8 黄金盟;中国甜柿遗传改良技术优化及新种质鉴定研究[D];华中农业大学;2016年

9 熊雅楼;中国甜柿‘鄂柿1号’自然和40℃温水脱涩前后差异蛋白质组学分析[D];华中农业大学;2016年

10 陈道明;中国原产完全甜柿‘鄂柿1号’自然脱涩特点研究[D];华中农业大学;2008年

本文编号：2879453