基于转录组分析菲牛蛭吸血相关基因的表达

发布时间：2020-11-11 22:58

　　 菲牛蛭Hirudinariamanillensis隶属于蛭纲无吻蛭目医蛭科牛蛭属,是一种在多个国家广泛分布的吸血水蛭。菲牛蛭在吸血时唾液腺可以分泌多种高效的抗凝血活性成分,具有巨大的药用潜力,近年来受到了人们的重点关注。目前对于菲牛蛭的研究多集中于分类、人工养殖、生物活性成分的提取及鉴定等方面,基因和遗传学研究的欠缺制约了人们对这种重要药用动物的了解及其药用研究进程。本研究通过对两种处理条件下菲牛蛭转录组的差异表达基因进行分析,为揭示菲牛蛭吸血习性相关机制及挖掘抗凝血新基因提供了新的证据。本研究利用Illumina HiSeq X Ten测序平台对菲牛蛭吸血前和吸血后两个状态的样本进行了转录组测序,对比了吸血前后菲牛蛭体内基因表达及相关代谢通路的变化,并对菲牛蛭吸血习性相关的三大类功能基因进行了深入挖掘。不仅阐明其吸血机制,还为菲牛蛭的药物开发提供了可靠的分子基础。最后,利用qRT-PCR对与11个差异表达基因进行了表达量的验证。研究结果和主要结论如下:1.构建了菲牛蛭吸血前后两个cDNA文库,经测序获得了总量为14.06 Gb的Clean data。进行转录组合并组装和拼接后,共获得55,998条总长度为37,208,146 bp 的 Unigene,其 GC 值为 43.70%,N50 为 1,391 bp,平均长度为 664.45 bp。2.将 All-Unigene 与 NR、KEGG、Pfam、COG、KOG、eggNOG4.5、Swiss-prot以及GO数据库进行比对后,共注释了 26,469条Unigene。其中,在NR数据库中基因的注释数目最多,占了已注释Unigene总数的75.58%,其中与泽蛭Helobdella robusta之间存在的同源序列最丰富。3.研究最终共获得40,603个CDS,长度介于100到1,000 bp范围内的CDS最多,共有35,009条,占比为84.16%。而长度为2,000 bp以上的CDS最少,仅有1,623条,占比为2.74%。4.对转录组数据进行RPKM标准化处理,并严格控制筛选标准(FDR≤0.01且差异倍数FC≥2),发现菲牛蛭吸血前、后共有2,371个基因发生差异表达,其中有892个基因的表达量在吸血后发生上调,1,479个基因的表达量发生下调。共有485个差异基因在GO数据库获得了功能注释,其中与能量代谢、蛋白质合成过程、应激反应和免疫过程相关的基因数量最多。对两组样品间的差异表达基因进行KEGG pathway分析显示:共有535个差异表达基因获得了注释并且涉及到174条代谢通路,显著富集的KEGG通路包括氧化磷酸化、核糖体代谢通路和MAPK信号通路等。进一步分析发现,在氧化磷酸化通路中,多个与电子传递链复合体相关的基因发生了下调,产能减弱。与此同时,多个与核糖体代谢途径相关的基因表达量发生上调。表明菲牛蛭吸血后代谢过程减弱,蛋白质合成过程显著增强。5.基于吸血动物在吸血过程中所具有的特点,选择了三个基因家族的基因进行挖掘,包括抗凝血相关的功能基因、涉及到免疫反应的功能基因以及涉及氧化应激反应的功能基因。结果显示,菲牛蛭在吸血后,与抗凝血、免疫、氧化应激反应相关的基因表达水平显著提高,这表明菲牛蛭的抗凝血反应、免疫反应以及应激反应都显著增强,在吸血过程中使得菲牛蛭可以顺利吸血,并且抵抗细菌的侵袭以及血红素的氧化胁迫。6.利用qRT-PCR对水蛭素(Hirudin)、乳清酸(Saratin)、凝血因子抑制剂(Antistasin)、蛋白酶抑制剂(Guamerin)、ATP 二磷酸水解酶(Apyrase)、失稳酶(Destabilase)、C型凝集素(Lectin C)、蛋白酶抑制剂(EglinC)以及血清纤维凝胶蛋白(Ficolin)的11个编码基因进行了表达量的验证。结果表明,qRT-PCR结果与RNA-Seq结果基本一致,证实了转录组测序结果的可靠性。
【学位单位】：陕西师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：Q953
【部分图文】：

图１－１水輕抗凝血剂的作用祀点。其中１表示Ａｎｔｉｓｔａｓｉｎ、Ｇｈｉｌａｎｔｈｅｎ和Ｔｈｅｒｏｓａｓｉｎ；２表示Ｈｉｒｕｄｉｎ、??Ｈａｅｍｅｎｄｉｎ?和?Ｂｕｆｒｕｄｉｎ；?３?表示?Ｃａｌｉｎ；?４?表示?Ｄｅｃｏｒｓｉｎ；?５?表示?Ｈｅｍｅｎｔｉｎ?和?Ｄｅｓｔａｂｉｌａｓｅ；?６?表??示?Ｈｅｍｅｎｔｅｒｉｎ??Ｆｉｇ?１－１?Ｔａｒｇｅｔｓ?ｏｆ?ｌｅｅｃｈ?ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔｓ．?１：?Ａｎｔｉｓｔａｓｉｎ，?Ｇｈｉｌａｎｔｈｅｎ，?Ｔｈｅｒｏｓａｓｉｎ；?２：?Ｈｉｒｕｄｉｎ，??Ｈａｅｍｅｎｄｉｎ，?Ｂｕｆｒｕｄｉｎ；?３：?Ｃａｌｉｎ；?４：?Ｄｅｃｏｒｓｉｎ；?５：?Ｈｅｍｅｎｔｉｎ，?Ｄｅｓｔａｂｉｌａｓｅ；?６：?Ｈｅｍｅｎｔｅｒｉｎ．??１．７研究内容及研究意义??１．７．１研究内容??菲牛蛭作为一种具有重大药用价值和养殖潜力的水蛭物种，目前相关的转录??组和基因组的相关研宄未见报道。本研究利用Ｉｌｌｕｍｉｎａ?ＨｉＳｅｑ?Ｘ?Ｔｅｎ测序平台对菲??牛蛭吸血前、后两组样本进行了转录组测序，对组装得到的菲牛蛭Ａｌｌ－Ｕｎｉｇｅｎｅ进??行了全局分析。之后采用差异表达分析法探究了吸血前、后菲牛蛭发生的基因表??达量和相关代谢通路的变化，并且对差异基因进行了功能基因挖掘。最后，利用??ｑＲＴ－ＰＣＲ对与抗凝血过程及免疫反应相关的１１个差异表达基因进行了表达量的验??证。??

图２－１?ｃＤＮＡ文库构建示意图??Ｆｉｇ?２－１?Ｆｌｏｗｃｈａｒｔ?ｏｆ?ｃＤＮＡ?ｌｉｂｒａｒｙ?ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ??文庠的Ｉｌｌｕｍｉｎａ高通量测序??库建库完成后，委托Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ?Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ公司对ｉｎａ公司的Ｈｉｓｅｑ?Ｘ?Ｔｅｎ测序平台完成高通量测序”方式，即对ｃＤＮＡ文库中的每条序列都从两端（５啷３ｃＤＮＡ序列便可以获得两个长度为１００?ｂｐ的读序（ｒ会相互识别，形成一对对ｐａｉｒｅｄ－ｅｎｄ?ｒｅａｄｓ。??程??数据的存储??序所得的数据由图像形式转化为序列数据，叫做Ｒａｗ格式为ｆａｓｔｑ。ｆａｓｔｑ格式的文件存储着每条ｒｅａｄｓ的序

第２章实验材料与方法菲牛蛭Ｕｎｉｇｅｎｅ的拼接组装??得菲牛蛭Ｃｌｅａｎ?ｒｅａｄｓ之后，使用Ｔｒｉｎｉｔｙ软件对其进行无参考基因（也ｗｏｗ?ａｓｓｅｍｂｌｙ）。Ｔｒｉｎｉｔｙ软件的组装过程分为以下三步：??（１）首先将测序Ｒｅａｄｓ打断来构建Ｋ－ｍｅｒ库，进而形成Ｃｏｎｔｉｇ；??（２）用Ｃｏｎｔｉｇ进行聚簇得到Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ，并构建Ｄｅ?Ｂｒｕｉｊｎ图；??３）对ＤｅＢｒｕｉｊｎ图进行优化，获得转录本序列。得到尽可能长的非（Ａｌｌ－Ｕｎｉｇｅｎｅ）?〇??
【参考文献】

相关期刊论文 前10条

1 贾昌路;张瑶;朱玲;张锐;;转录组测序技术在生物测序中的应用研究进展[J];分子植物育种;2015年10期

2 辛效威;彭兆红;叶菁;;高通量测序在分子诊断中的应用及其标准化管理初探[J];标准科学;2015年10期

3 潘雪;严亚萍;林亚明;;菲牛蛭近20年的研究进展[J];中西医结合研究;2015年04期

4 李晓燕;王晓铄;王乐乐;张燕军;苏蕊;王瑞军;李金泉;;转录组测序技术在绒毛用羊中的应用研究进展[J];中国畜牧兽医;2015年07期

5 李军;于翔;张健;张涛;龚元;金广海;;4种水蛭粗提物抗凝活性及冻存时间对菲牛蛭抗凝活性影响[J];水产科学;2014年09期

6 周军;;水蛭的研究进展[J];天津药学;2014年04期

7 杨帆;黄立华;张爱兵;;高通量转录组测序技术及其在鳞翅目昆虫上的应用[J];昆虫学报;2014年08期

8 陈嘉贝;张芙蓉;黄丹枫;张利达;张屹东;;盐胁迫下两个甜瓜品种转录因子的转录组分析[J];植物生理学报;2014年02期

9 许波;张伟强;冯晓曦;王成业;张海申;许海涛;王友华;张今瀚;;转录组测序技术在玉米中的应用研究进展[J];玉米科学;2014年01期

10 张棋麟;袁明龙;;基于新一代测序技术的昆虫转录组学研究进展[J];昆虫学报;2013年12期

相关博士学位论文 前7条

1 李扬威;基于比较转录组的棕色田鼠与布氏田鼠低氧适应研究[D];郑州大学;2017年

2 何骋;转录组测序数据分析在玉米籽粒功能基因挖掘中的应用[D];中国农业大学;2017年

3 王志秀;基于转录组和蛋白组数据鉴定猪肌肉生长和脂肪沉积相关的基因[D];中国农业大学;2017年

4 王羽君;烟粉虱三个隐种雌雄虫转录组的研究与烟粉虱进化机制探讨[D];浙江大学;2016年

5 雷鸣;转录组分析研究蝙蝠系统发育以及回声定位和冬眠的分子机制[D];华东师范大学;2016年

6 彭晓剑;不同类型玉米胚乳转录组及其淀粉代谢相关基因分析[D];安徽农业大学;2015年

7 董迎辉;泥蚶高通量转录组分析及生长相关基因的克隆与表达研究[D];中国海洋大学;2012年

相关硕士学位论文 前10条

1 车荣波;基于转录组数据的鮸鱼分子标记筛选及基因差异表达分析[D];浙江海洋学院;2015年

2 陈春燕;进化中新基因的鉴别和重注释[D];中国科学技术大学;2014年

3 刘言香;菲牛蛭素对凝血酶诱导内皮细胞活性、vWF、PAI-1、t-PA分泌、mRNA表达及对血管新生作用的研究[D];广西医科大学;2014年

4 李霞;东方蝼蛄（Gryllotalpa Orientialis）线粒体基因组及转录组研究[D];陕西师范大学;2014年

5 李桃;宽体金线蛭的化学成分研究[D];暨南大学;2013年

6 刘红亮;基于高通量测序的辽宁绒山羊转录组研究与应用[D];西北农林科技大学;2013年

7 杨婧;短额负蝗三种虫态的比较转录组及线粒体转录组作图研究[D];陕西师范大学;2013年

8 乔宁;三种金线蛭吸盘和颚的形态及分类价值研究[D];陕西师范大学;2013年

9 邵亚峰;菊花蚜虫抗性相关基因表达谱分析及microRNA发掘[D];南京农业大学;2013年

10 刘畅;储藏害虫米象的转录组分析及逆境对相关基因表达的影响[D];合肥工业大学;2013年

本文编号：2879873