节节麦-黑麦双二倍体及其亲本HMW-GS基因的克隆与变异分析

发布时间：2020-11-14 11:52

　　 植物远缘杂交和多倍体化是新物种形成的主要途径,也是促进植物进化的重要动力。由于亲本基因组间的相互作用,异源多倍体化大多伴随着广泛的,快速的遗传及表观遗传变异。高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)是小麦胚乳中重要的贮藏蛋白之一,其组成和含量决定了面团弹性和面包加工品质。节节麦(Aegilops tauschii Cosson,2n=2x=14,DD)和黑麦(Secale cereale,2n=2x=14,RR)含有许多优良的农艺性状,被广泛应用于小麦的遗传改良,本研究以节节麦-黑麦双二倍体(2n=4x=28,DDRR)及其亲本为材料,通过定向缺失亚克隆的方法获取HMW-GS基因序列,对序列进行比对,分析HMW-GS基因在双二倍体中的序列变异特点,为深入研究远缘杂交过程中由于外源基因组导入引起的功能基因序列改变提供理论依据。取得的研究成果如下:(1)根据HMW-GS基因序列两端有高度的保守性,设计引物对节节麦-黑麦双二倍体以及亲本进行PCR扩增,亲本节节麦和黑麦分别扩增出两条带,双二倍体共检测到三条带,双二倍体中分子量最大条带和最小条带与亲本节节麦的Dx5和Dy10.5亚基基因大小一致,中间条带是两亲本都未出现的新麦谷蛋白条带,而黑麦的Rx2和Ry6.5亚基基因在双二倍体材料中未检测到,由于HMW-GS基因序列分子量较大且内部存在大量重复序列,针对此问题需要利用亚克隆方法获得基因的全长序列,节节麦中的HMW-GS基因暂命名为At-Dx5、At-Dy10.5,黑麦中的HMW-GS基因暂命名为Sc-Rx2、Sc-Ry6.5,节节麦-黑麦双二倍体中的HMW-GS基因暂命名为AS-Dx5、AS-Rx7*、AS-Dy10.5。(2)节节麦At-Dx5、At-Dy10.5亚基基因序列全长分别为2514 bp、1968 bp,和它们迁移率一致的双二倍体中的AS-Dx5和AS-Dy10.5基因序列全长也为2514 bp和1968 bp。利用ClustalX2和Bioedit软件分别对At-Dx5和AS-Dx5、At-Dy10.5和AS-Dy10.5基因序列比对,结果发现作为母本节节麦的HMW-GS基因(x-型和y-型)在双二倍体中变化很小,仅有个别的SNP差异。(3)双二倍体中新HMW-GS基因AS-Rx7*序列全长为2196 bp,与亲本黑麦Sc-Rx2和Sc-Ry6.5基因核苷酸比对发现,AS-Rx7*基因的核苷酸序列的前半部分1-948 bp以及结尾部分2305-2196 bp与亲本黑麦的Rx亚基基因基本一致,948-2305 bp之间有部分与亲本黑麦的Ry亚基基因一致,于是我们推测新亚基可能是由于亲本黑麦Rx和Ry亚基基因通过不等交换产生的。AS-Rx7*亚基与已知的Rx亚基氨基酸比对结果显示AS-Rx7*亚基在靠近N-端非重复区的中央重复区比其它Rx亚基多含有一个半胱氨酸残基,因此我们猜测该亚基可能具有提高面粉加工品质的潜能。将AS-Rx7*基因的核苷酸序列与亲本x-型、y-型亚基基因的核苷酸序列进行系统进化树构建,AS-Rx7*基因与黑麦Sc-Rx2基因聚在了一起,说明与黑麦Rx亚基亲缘关系更近。AS-Rx7*亚基在原核细胞中成功表达,它的条带迁移率与种子蛋白Rx亚基基因的条带基本一致。
【学位单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S512.1
【部分图文】：

图 3-1 节节麦-黑麦双二倍体及其亲本 HMW-GS 基因的 PCR 扩增产物电泳图M：DL2000 DNA marker；1：双二倍体；2：黑麦；3：节节麦Fig. 3-1 PCR amplification products electrophoresis of HMW-GS gene in DDRR and its parenM: DL2000 DNA marker; 1: The amphidiploid; 2: S.cereale; 3: Ae. tauschii

图 3-2 对 AS-Dx5 缺失亚克隆进行单酶切的线性质粒电泳图Fig. 3-2 Linear plasmid electropherograms for single digestion of AS-Dx5 deletion subclones

长度不同的单链，琼脂糖凝胶检测并回收纯化，检测结果如图 3-2 所示，琼脂糖凝胶收纯化后自连形成一系列的缺失亚克隆。用M13R/F通用引物PCR检测菌落片段长度果如图 3-3 所示，筛选出片段大小合适的亚克隆，通过亚克隆测序拼接获得它们的全列。图 3-2 对 AS-Dx5 缺失亚克隆进行单酶切的线性质粒电泳图Fig. 3-2 Linear plasmid electropherograms for single digestion of AS-Dx5 deletion subclones
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本文编号：2883444