古菌中LysM结构域基因的挖掘及功能初探
发布时间：2020-11-16 06:18
LysM结构域在植物识别病原菌入侵并激发植物免疫防御方面具有重要作用。目前已在原核生物和真核生物基因组内鉴定到大量LysM结构域基因,但迄今为止未在古菌中发现LysM结构域基因的存在。随着近几年高通量测序技术的快速发展,大量古菌基因组序列被测定,古菌中是不是存在LysM结构域基因?如存在,其功能是否与植物免疫防御相关?基于这些疑问,本研究通过收集公共数据库中公布的古菌基因组序列信息,挖掘古菌基因组中的LysM结构域基因并进行系统发育分析;选取具有代表性的古菌LysM结构域基因利用原核表达进行功能分析;同时在拟南芥LysM结构域功能缺失突变体中异源表达探究其真菌病原菌识别激发植物免疫反应功能特性。对古菌LysM结构域基因的研究对于植物LysM基因的起源具有重要的理论意义,同时在作物抗逆育种中也具有潜在的应用价值。主要研究结果如下:1.利用NCBI和Ensembl Bacteria网站获得了441种无冗余的已测序古菌基因组序列,通过功能结构域分析,从中鉴定到27种古菌含有LysM结构域,从而证实古菌中同样存在LysM结构域。2.根据这些古菌的分类信息以及鉴定到的LysM结构域蛋白的氨基酸序列信息,推断出古菌的LysM结构域主要存在于广古菌门中,且LysM结构域主要位于相关蛋白氨基酸序列的C端。3.构建Halobiforma_nitratireducens古菌的LysM结构域基因(HnLysM)的原核表达载体,通过Western blot证实其表达后进行蛋白纯化,多糖结合实验证实其几丁质特异性结合活性,但是酶活分析表明其不具有几丁质酶活性。4.构建植物表达载体,将HnLysM在拟南芥LysM结构域功能缺失突变体cerk1-2中异源表达,玉米长蠕孢菌接种实验显示突变体与转基因株系受真菌侵染程度无明显差异,表明HnLysM并没有恢复AtCERK1的几丁质触发植物免疫反应功能。本研究初步表明古菌中LysM结构域基因功能完全不同于真菌同源基因的几丁质水解功能及植物同源基因的免疫防御识别功能,其功能有待进一步分析。
【学位单位】：安徽农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：Q933
【部分图文】：
物主要分为 3 大领域，即真核生物域（Eucarya）、细菌chaea）[1]。细菌和古菌都属于原核生物，二者的细胞核和核没有核膜包裹，染色体呈环状，而二者的不同在于细菌菌不含有肽聚糖[2]。Woese 等通过对真核生物、细菌、古许多来自极端环境下的微生物具有既不同于真核生物也，于 1990 年首次提出了“三域学说”[3]。后续的相关研究录、翻译和剪接又和真核生物类似，认为细菌和古菌与真——原始细胞（Progenote），而细菌首先从古菌和真核生图 1.1）[4]。此外对极端微生物的分离和宏基因组的探究育有了一个较全面的认知和理解[5]。古菌不仅与其它生物的生物具有十分广泛的生物多样性[6, 7]。按照 16S rRNA泉古菌门（Crenarchaeota）、广古菌门（Euryarchaeotta）、奇古菌门（Thaumarchaeota）和初古菌门（Korar
通常由富含 Ser、Thr、Asp、Pro 的序列相连，从而有助于在这些结构域之间形对灵活的区域[20, 21]。在原核生物中，LysM 结构域蛋白主要靠形成大量的二级结例如α-螺旋、β-折叠、β-转角等)和氢键形成稳定的三级结构；而真核生物中的 Ly构域则主要依靠二硫键来保持其结构的稳定性[22]。相关研究表明，LysM 结构域与超过 50 种结构域组合形成不同的蛋白结构域骨架，其中最常见也是最简单的只含有 1 个 LysM 结构域，基本存在于所有物种中[22]，而另一种最常见的则含有LysM结构域和1个肽酶结构域，这种主要存在于原核生物以及非微管类植物中[1
序列分别与 3.2.1 下载的古菌基因组序列逐一对比，从不同古菌中筛选 结构域的序列。 古菌 LysM 结构域蛋白氨基酸序列分析方法于 3.2.2 获得的相应氨基酸序列，删除重复后利用 clastal W 软件和 DN行序列比对和同源性分析，利用 MEGA6.0 软件基于 Poisson correction进化树（Neighbor-Joining tree）。选取目的基因片段后，利用 Sig://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）在线网站进行分泌性信号肽预M Server v. 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）在线网站进预测分析。 原核表达核表达载体构建方法研究中用到的原核表达载体为 pET-28b(+)，其载体图谱如图 3.1 所示。
【参考文献】
本文编号：2885724
【学位单位】：安徽农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：Q933
【部分图文】：
物主要分为 3 大领域，即真核生物域（Eucarya）、细菌chaea）[1]。细菌和古菌都属于原核生物，二者的细胞核和核没有核膜包裹，染色体呈环状，而二者的不同在于细菌菌不含有肽聚糖[2]。Woese 等通过对真核生物、细菌、古许多来自极端环境下的微生物具有既不同于真核生物也，于 1990 年首次提出了“三域学说”[3]。后续的相关研究录、翻译和剪接又和真核生物类似，认为细菌和古菌与真——原始细胞（Progenote），而细菌首先从古菌和真核生图 1.1）[4]。此外对极端微生物的分离和宏基因组的探究育有了一个较全面的认知和理解[5]。古菌不仅与其它生物的生物具有十分广泛的生物多样性[6, 7]。按照 16S rRNA泉古菌门（Crenarchaeota）、广古菌门（Euryarchaeotta）、奇古菌门（Thaumarchaeota）和初古菌门（Korar
通常由富含 Ser、Thr、Asp、Pro 的序列相连，从而有助于在这些结构域之间形对灵活的区域[20, 21]。在原核生物中，LysM 结构域蛋白主要靠形成大量的二级结例如α-螺旋、β-折叠、β-转角等)和氢键形成稳定的三级结构；而真核生物中的 Ly构域则主要依靠二硫键来保持其结构的稳定性[22]。相关研究表明，LysM 结构域与超过 50 种结构域组合形成不同的蛋白结构域骨架，其中最常见也是最简单的只含有 1 个 LysM 结构域，基本存在于所有物种中[22]，而另一种最常见的则含有LysM结构域和1个肽酶结构域，这种主要存在于原核生物以及非微管类植物中[1
序列分别与 3.2.1 下载的古菌基因组序列逐一对比，从不同古菌中筛选 结构域的序列。 古菌 LysM 结构域蛋白氨基酸序列分析方法于 3.2.2 获得的相应氨基酸序列，删除重复后利用 clastal W 软件和 DN行序列比对和同源性分析，利用 MEGA6.0 软件基于 Poisson correction进化树（Neighbor-Joining tree）。选取目的基因片段后，利用 Sig://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）在线网站进行分泌性信号肽预M Server v. 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）在线网站进预测分析。 原核表达核表达载体构建方法研究中用到的原核表达载体为 pET-28b(+)，其载体图谱如图 3.1 所示。
【参考文献】
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本文编号：2885724
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