黄颡鱼IL-1β和IL-1RI基因的克隆及表达分析

发布时间：2020-11-16 12:58

　　 黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)是我国重要的淡水经济鱼类之一。近年来,随着我国水产养殖业的快速发展,黄颡鱼养殖业也因受到细菌性疾病的危害而造成了较严重的经济损失。白细胞介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)是一种关键的早期促炎症细胞因子,在调节免疫反应以及细菌感染时诱导一系列炎症反应方面具有重要作用。白细胞介素I型受体(IL-1RI)可以结合IL-1β并能调节依赖IL-1的激活作用。因此,对黄颡鱼白细胞介素1β(Pf_IL-1β)和其受体I(Pf_IL-1RI)基因的分子特征以及在免疫反应中的作用进行研究,对黄颡鱼的病害防控具有重要的意义。本研究克隆了黄颡鱼Pf_IL-1β和Pf_IL-1RI基因部分cDNA序列并对其分子特征进行了分析。采用荧光定量PCR技术对黄颡鱼Pf_IL-1β和Pf_IL-1RI基因在成鱼不同组织、早期发育时期的时空表达进行了分析,对鮰爱德华氏菌刺激后2个基因在黄颡鱼6种组织中的表达变化进行了检测。采用免疫印迹实验检测了黄颡鱼Pf_IL-1β蛋白在成鱼的组织分布及鮰爱德华氏菌刺激后在头肾中表达的变化。主要结果如下:1.黄颡鱼Pf_IL-1β和Pf_IL-1RI基因cDNA序列的克隆和序列分析黄颡鱼Pf_IL-1βcDNA部分序列长度1102 bp,包含一个编码280个氨基酸序列的843 bp的开放阅读框和259 bp的3'非翻译区(UTR),3'端有3个mRNA不稳定基序(ATTTA)和1个多腺苷酸信号序列(AATAAA)。BLAST序列比较显示Pf_IL-1β氨基酸序列与斑点叉尾鮰IL-1β的相似性最高(86.4%),其次为斑马鱼(52.3%)和鲤(44.3%)。黄颡鱼Pf_IL-1RI基因cDNA序列开放阅读框长度1632 bp,编码543个氨基酸。Pf_IL-1RI氨基酸序列与墨西哥脂鲤(53.8%)、大西洋鲑(45.3%)和斑马鱼(45.0%)的IL-1RI相似性较高。2.黄颡鱼Pf_IL-1β和Pf_IL-1RI基因mRNA在成鱼各组织及早期发育时期的表达黄颡鱼Pf_IL-1β和Pf_IL-1RI基因mRNA在成鱼13种组织中均有表达。Pf_IL-1βmRNA在体肾、血液、心脏、肌肉、头肾和脾脏中的表达量较高,Pf_IL-1RI mRNA在血液中表达量最高,其次是肝脏、脾脏、体肾和头肾。在黄颡鱼早期发育阶段,Pf_IL-1βmRNA在未受精卵中的表达量极高,表达量在受精卵中显著降低到中等水平,在多细胞期进一步降低到较低水平。从囊胚晚期到心跳期,除了肌肉效应期表达量较低之外,Pf_IL-1βmRNA表达量处于中等水平。Pf_IL-1βmRNA表达量在出膜前期显著下降到较低水平,并持续至出膜后第10 d。在黄颡鱼未受精卵中未检测到Pf_IL-1RI mRNA的表达,在受精卵中Pf_IL-1RI mRNA表达量显著上升至中等水平,在体节出现期其表达量达到峰值。随后,Pf_IL-1RI mRNA表达量在肌肉效应期显著下降,并逐渐在出膜前期下降至较低水平。从孵出至出膜后第5 d,Pf_IL-1RI mRNA表达量处于较低水平,但在出膜后第7~10 d,其表达量显著上升至中等水平。3.鮰爱德华氏菌刺激后黄颡鱼Pf_IL-1β和Pf_IL-1RI基因mRNA在6种组织中表达量的变化鮰爱德华氏菌感染后黄颡鱼Pf_IL-1β和Pf_IL-1RI基因mRNA在体肾、头肾、血液、脾脏、心脏和肝脏中的表达量均显著上调。在体肾和头肾中,Pf_IL-1βmRNA在鮰爱德华氏菌刺激后从6~120 h均为极显著上调。在体肾中,Pf_IL-1βmRNA表达量逐渐升高并在72 h达到峰值,然后在120 h降到中等水平,而在头肾中,其表达量在6 h快速达到峰值,然后在48~120 h逐渐降至中等水平。在血液中,Pf_IL-1βmRNA表达量除了在12 h上调外,6~48 h都显著下调,然后在72 h显著上调并达到峰值。在心脏中,其表达量在6 h显著上调,在24 h进一步升高并达到峰值,然后在48 h降低至较低水平,48~120 h有所波动。在脾脏中,Pf_IL-1βmRNA表达量在6 h时显著上调,24 h达到较高水平,48 h有所下降后再一次升高并在120 h达到最大值。在肝脏中,其表达量在6 h显著上调,然后进一步升高并在72 h达到峰值。在体肾中,黄颡鱼Pf_IL-1RI mRNA表达量从6~24 h均极显著下调,在48 h显著上调并在72 h达到峰值,后在120 h极显著下调。在头肾中,Pf_IL-1RI mRNA表达量在6 h显著上调并逐渐升高到72 h达到最大值,然后在120 h显著下调。在血液和心脏中,鮰爱德华氏菌刺激后Pf_IL-1RI mRNA表达量在6~120 h均显著上调,血液中的表达量在12 h达到峰值而心脏中的表达量在48 h达到峰值。在脾脏中,其表达量在6 h轻微上调,12~120 h显著上调且在24 h达到峰值。在肝脏中,Pf_IL-1RI mRNA表达量在6 h达到峰值,除了在72 h显著下调外,在12~120 h均显著上调。4.黄颡鱼Pf_IL-1β蛋白的诱导表达和免疫印迹分析重组原核表达载体pGEX-4T-1β被成功构建。重组蛋白在28°C,IPTG浓度为1.0 mM,培养5 h的最佳诱导条件下在包涵体中大量表达。免疫印迹实验显示黄颡鱼Pf_IL-1β蛋白在成鱼各组织中的脾脏和头肾里表达量较高,但在鳍条中未被检测到。鮰爱德华氏菌刺激后24~120 h,Pf_IL-1β蛋白在黄颡鱼头肾中显著上调。
【学位单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S917.4
【部分图文】：

88（MyD 88）、IL-1受体相关激酶（IRAK）和肿瘤坏死因子受体相关分子6（TRAF6），来激活NF-κB通路和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联（p38，JNK，ERK），启动细胞核中一系列基因的表达（Lu et al 2008）（图1-1）。

以及早期发育阶段，采用 S差分析（One-WayANOVA）免疫刺激试验中，对照组和检验。分析基因的相对表达1，则认为有极显著差异。NA 质量进行了检测，其吸 纯度的要求。经过琼脂糖电带，它们分别为 28S、18S 和 录实验。

3'UTR含有 3 个 mRNA 不稳定基序（ATTTA）和 1 个多腺苷酸信号序列（AATAAA）（图2-2/2-3）。预测其蛋白分子量约为 31.85 kDa，等电点为 4.99。图 2-2 黄颡鱼 Pf_IL-1β 基因扩增产物Fig. 2-2 PCR amplification product of partial Pf_IL-1β cDNA of P. fulvidracoM：2000 bp DNA Marker；1：中间片段扩增产物；2：3' RACE 产物。M: 2000 bp DNA Marker; 1: product of Pf_IL-1β; 2: product of 3' RACE.
【参考文献】

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本文编号：2886257