番木瓜体胚发生转录组分析和胚胎发育基因表达的研究

发布时间：2020-11-17 00:10

　　 番木瓜是二倍体双子叶草本植物,含有18条染色体,其基因组草图已构建完成。由于其生长周期短、性别多样及结籽多等特点,使番木瓜成为研究植物性别决定的模式植物之一。番木瓜植株有三种性别,分别为雌性(XX)、雄性(XY)和两性(XYh),在番木瓜产业化种植中多采用可自交结果的两性植株,但是两性植株的种子存在性别分离的现象,无法持续获得两性种子,需要采取前期过度密植、后期间苗的种植方法;此外,番木瓜果实中大量种子的存在为番木瓜产业化深加工带来技术难度,造成番木瓜副加工产业难以成形。这两个问题对番木瓜的产业化种植和加工工业影响深刻。本研究通过对番木瓜胚胎发育过程的分析,综合胚胎发育候选基因Cp49的功能分析,同时对番木瓜胚胎发育相关基因的突变体的筛选和鉴定,为实现XYh性别不分离和无籽番木瓜新种质的创建提供可能,并为最终解决番木瓜商业化种植和加工的难题提供研究基础。前期研究发现在番木瓜性别决定区域中存在一些与胚胎发育相关的基因,本研究主要对它们的表达与调控进行研究,结果如下:1.番木瓜体细胞胚发生和转录组分析对番木瓜体细胞胚进行形态学和组织学观察,根据其不同发育阶段的特点,将番木瓜体细胞胚划分为四个发育阶段,分别为球形胚阶段、心形胚阶段、鱼雷胚阶段和子叶胚阶段。通过转录组研究分析番木瓜雌性体细胞胚和两性体细胞胚不同发育时期的差异表达基因。主要分为两个方面进行比较:(1)分析两种性别、同一发育时期体细胞胚中差异表达基因。结果显示,在胚胎发育的早期阶段,雌性番木瓜和两性番木瓜在基因表达上已经出现明显差异。在球形胚发育阶段,差异基因主要集中在细胞壁的形成过程;而心形胚形成阶段,表达差异体现在物质和能量代谢通路相关基因;鱼雷胚阶段主要区别在核小体和染色质的组装过程中的相关基因;子叶胚阶段差异基因主要参与细胞核内物质的形成、代谢过程以及分生组织的形成及分化。(2)分析同一性别胚胎发育过程中的基因表达趋势。结果显示,心形胚阶段和鱼雷胚阶段是番木瓜体细胞胚发育的关键节点,分别有89%和83%的基因表达在心形胚和鱼雷胚阶段出现转折,表现出明显的上调或者下调趋势。2.利用TILLING方法筛选胚胎发育相关基因的突变体前期试验结果表明,番木瓜性别决定区域的相关基因可能影响胚胎发育。利用EMS诱变剂处理番木瓜种子,构建M1代诱变群体,通过高通量测序筛选突变体,并通过PCR测序进行验证,共发现三株阳性突变体植株,其分别为cpxyh3、emb506和pxcpxyh14基因的错义突变体。3.番木瓜胚胎发育候选基因Cp49的时空表达模式为了探究Cp49基因的表达模式,利用qRT-PCR技术对Cp49基因的组织表达特异性分析,结果显示其在体细胞胚发育的球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚阶段均有表达,且表达量逐渐降低,Cp49基因在球形胚时期表达量最高,子叶胚时期表达量最低。4.番木瓜Cp49互补拟南芥同源基因emb976突变体通过构建番木瓜Cp49的基因进化树,找到其亲缘关系最近的同源基因EMB976。试验发现,拟南芥emb976的T-DNA插入杂合突变体子叶胚时期表现出部分胚胎败育,败育率约为25%。为了探究番木瓜Cp49与拟南芥同源基因在功能上是否保守,构建拟南芥EMB976自身启动子驱动Cp49全长CDS的表达载体,利用农杆菌介导的侵花转化法转化拟南芥突变体emb976,结果发现番木瓜Cp49基因异源表达可部分恢复拟南芥emb976的胚胎败育的表型,说明Cp49和EMB976基因功能具有一定的保守性。5.番木瓜转基因研究为了进一步探究番木瓜Cp49的功能,我们构建了番木瓜Cp49-X-CRISPR/Cas9 基因编辑载体、Cp49-XYh-CRISPR/Cas9 基因编辑载体和Cp49-XYh-RNAi载体,通过农杆菌侵染法将它们分别转化番木瓜愈伤组织,经过筛选目前已得到Cp49-XYh-CRISPR/Cas9潮霉素抗性筛选植株和Cp49-XYh-RNAi潮霉素抗性筛选的愈伤组织,为下一步深入研究Cp49基因的功能提供了实验材料。
【学位单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S667.9
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略词表
第一章 综述
    1.1 番木瓜概述
    1.2 胚胎发育相关研究进展
        1.2.1 胚胎发育的过程
        1.2.2 胚胎发育相关基因的研究
        1.2.3 EMB976基因的相关研究
    1.3 体细胞胚发育的相关研究
    1.4 TILLING技术的发展和应用
        1.4.1 TILLING技术概述
        1.4.2 TILLING技术发展
        1.4.3 TILLING技术的流程
        1.4.4 TILLING技术的应用
    1.5 本研究的研究目的和意义
        1.5.1 番木瓜产业化种植的便利性
        1.5.2 为无籽番木瓜培育奠定基础
第二章 番木瓜体细胞胚发生的形态学、组织细胞学观察及转录组分析
    2.1 实验材料
    2.2 仪器与试剂
    2.3 实验方法
        2.3.1 胚性愈伤组织的诱导
        2.3.2 胚性愈伤组织的性别鉴定
        2.3.3 体细胞胚发育的形态学观察
        2.3.4 体细胞胚发育的组织学观察
        2.3.5 体细胞胚的转录组分析
    2.4 结果与分析
        2.4.1 番木瓜体细胞胚性别鉴定
        2.4.2 番木瓜体细胞胚发育过程观察
        2.4.3 番木瓜体细胞胚发育过程组织学观察
        2.4.4 转录组分析
    2.5 讨论
第三章 TILLING筛选番木瓜胚胎发育相关基因突变体
    3.1 实验材料
    3.2 实验仪器与试剂
    3.3 实验方法
        3.3.1 EMS诱变处理
        3.3.2 幼苗移栽
        3.3.3 基因组DNA提取
        3.3.4 目的片段扩增
        3.3.5 DNA建库
        3.3.6 文库测序
        3.3.7 数据分析
        3.3.8 初步验证
    3.4 实验结果与分析
    3.5 讨论
第四章 Cp49基因在拟南芥同源基因突变体中的表达与恢复
    4.1 实验材料
    4.2 仪器与试剂
    4.3 实验方法
        4.3.1 物种基因进化树构建
        4.3.2 恢复载体构建
        4.3.3 拟南芥突变体表型鉴定
        4.3.4 浸花转化法转化拟南芥突变体植株
        4.3.5 转基因拟南芥的鉴定
    4.4 结果与分析
        4.4.1 系统进化树构建
        4.4.2 拟南芥恢复载体构建
        4.4.3 拟南芥突变体鉴定
        4.4.4 恢复载体转化苗的鉴定与表型观察
    4.5 讨论
第五章 Cp49基因在番木瓜中的敲除和沉默表达
    5.1 实验材料
    5.2 仪器与试剂
    5.3 实验方法
h基因编辑载体的构建'>        5.3.1 番木瓜Cp49-XY^h基因编辑载体的构建
        5.3.2 番木瓜Cp49-X基因编辑载体的构建
        5.3.3 番木瓜RNAi载体构建
        5.3.4 番木瓜Cp49基因在体胚发生过程中的表达
        5.3.5 番木瓜愈伤诱导及转化
    5.4 结果及分析
        5.4.1 载体构建验证
        5.4.2 Cp49基因在体胚发生过程中的表达
        5.4.3 番木瓜愈伤组织的诱导
        5.4.4 番木瓜遗传转化
    5.5 讨论
第六章 结论与展望
    6.1 结论
    6.2 展望
参考文献
附录
致谢

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本文编号：2886832