仿刺参类硫氧还蛋白基因克

发布时间：2020-12-06 00:26

　　仿刺参具有很高的营养价值和经济价值,是我国沿海最重要的养殖品种之一。然而,近年来,各个年龄段的仿刺参病害的大规模爆发对其养殖产业造成了严重威胁,深入研究刺参的抗病机制和有效防治途径已经成为当前仿刺参养殖基础研究中的热点。本文以仿刺参[Apostichopus japonicus（Slenka）]为研究对象,通过RACE克隆技术获得了仿刺参类硫氧还蛋白（AjTRX）基因的cDNA序列,运用荧光定量PCR技术研究了其在不同组织和灿烂弧菌（Vibrio splendidus）刺激后的表达情况;此外,参照基因工程技术表达和纯化出了AjTRX基因的重组蛋白,并对其的活性进行了验证;最后,通过RNA干扰技术研究了AjTRX基因与活性氧（ROS）生成量之间的关系。主要研究结果如下:1.本实验结合转录组文库的筛查结果和RACE克隆技术,首次得到了仿刺参AjTRX基因的cDNA全长。AjTRX基因的cDNA全长1870 bp,由一个882 bp的编码293个氨基酸的开放阅读框,一个101 bp的5’非编码区和一个887 bp的3’非编码区组成。AjTRX基因预测的氨基酸的分子量和等电点分别是32.3 k... 

【文章来源】：大连海洋大学辽宁省

【文章页数】：76 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
    1.1 仿刺参的养殖现状和病害研究
    1.2 硫氧还蛋白（TRX）系统的研究
    1.3 抗氧化系统的研究进展
        1.3.1 超氧化物歧化酶（SOD）
        1.3.2 过氧化氢酶（CAT）
        1.3.3 谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）
        1.3.4 硫氧还蛋白过氧化物酶（TPX）
    1.4 仿刺参的先天性免疫系统
    1.5 本研究的目的及意义
第二章 仿刺参AJTRX基因的克隆与时空表达分析
    2.1 材料与方法
        2.1.1 实验材料
        2.1.2 细菌培养及样品收集
        2.1.3 实验主要试剂
        2.1.4 主要实验试剂的配制
        2.1.5 引物设计
        2.1.6 总RNA的提取
        2.1.7 AjTRX基因第一链cDNA链的合成
        2.1.8 3 ’RACE和5’RACE
        2.1.9 PCR产物的回收与纯化
        2.1.10 AjTRX基因的克隆与测序
        2.1.11 序列分析
        2.1.12 AjTRX基因cDNA的合成
        2.1.13 AjTRX基因荧光定量分析
    2.2 结果
        2.2.1 总RNA提取结果
        2.2.2 AjTRX基因的RACE扩增结果
        2.2.3 AjTRX基因的菌落PCR鉴定
        2.2.4 AjTRX基因cDNA的全长及其序列分析
        2.2.5 AjTRX氨基酸序列的同源性分析和进化分析
        2.2.6 AjTRX基因组织分布
        2.2.7 灿烂弧菌刺激后体腔细胞中AjTRX基因的表达情况
    2.3 讨论
第三章 仿刺参类硫氧还蛋白的活性分析
    3.1 材料与方法
        3.1.1 材料
        3.1.2 主要试剂
        3.1.3 重组蛋白引物的设计
        3.1.4 AjTRX重组蛋白（rAJTRX）的表达和纯化
        3.1.5 rAJTRX的SDS-PAGE,复性和浓度测定
        3.1.6 rAJTRX的活性检测
        3.1.7 统计分析
    3.2 结果
        3.2.1 SDS-PAGE结果分析
        3.2.2 抗氧化性结果说明
    3.3 讨论
第四章 仿刺参AJTRX基因的功能验证
    4.1 材料与方法
        4.1.1 主要试剂
        4.1.2 仿刺参体腔细胞的原代培养
        4.1.3 体外及体内miRNA干扰
        4.1.4 干扰效率分析
        4.1.5 ROS生成量的测定
    4.2 结果
        4.2.1 总RNA的提取
        4.2.2 AjTRX基因体外干扰效率的分析
        4.2.3 AjTRX基因体内干扰效率的分析
        4.2.4 AjTRX基因体外干扰对ROS生成量的影响
        4.2.5 AjTRX基因体内干扰对ROS生成量的影响
    4.3 讨论
参考文献
攻读硕士学位期间发表的学术论文
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]四种不同添加物对仿刺参非特异性免疫力和肠道免疫基因Aj-p105、Aj-p50、Aj-rel和Aj-lys mRNA表达的影响[J]. 阳钢,田相利,董双林,彭墨,王栋栋,张凯.  水产学报. 2015(05)
[2]黄河三角洲地区仿刺参养殖池中混养日本对虾的试验[J]. 左明,张士华,隋凯港,刘志国,赵磊.  水产科技情报. 2014(05)
[3]刺参密度对鲍参混养效果的影响[J]. 王云.  福建农业学报. 2014(07)
[4]复方中草药对大菱鲆非特异性免疫力的影响[J]. 李华,张太娥,李强.  大连海洋大学学报. 2013(02)
[5]24-表油菜素内酯对低温胁迫下葡萄幼苗抗氧化系统及渗透调节物质的影响[J]. 惠竹梅,王智真,胡勇,邓敏敏,张振文.  中国农业科学. 2013(05)
[6]刺参龙须菜混养系统中细菌数量与群落组成[J]. 高菲,孙慧玲,王肖君,谭杰,燕敬平.  渔业科学进展. 2012(04)
[7]西施舌稚贝与仿刺参幼参混养的研究[J]. 李文波,高如承,潘辉,陈志.  福建师范大学学报(自然科学版). 2012(04)
[8]饲料中添加益生菌对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)非特异免疫基因表达量和抗病力的影响[J]. 孙艳,刘飞,宋晓玲,麦康森,李玉宏,黄倢.  海洋与湖沼. 2012(04)
[9]全营养破壁酵母对仿刺参非特异性免疫及肠道菌群的影响[J]. 宫魁,王宝杰,刘梅,蒋克勇,孙姝娟,王雷,范瑞用,张连润,张连水.  中国水产科学. 2012(04)
[10]饲料中添加硒酵母和维生素E对刺参生长、免疫力及抗病力的影响[J]. 张琴,麦康森,张文兵,马洪明,艾庆辉,徐玮,刘付志国.  动物营养学报. 2011(10)

博士论文
[1]松江鲈（Trachidermus fasciatus）抗氧化相关基因的克隆、表达与功能分析[D]. 刘莹莹.山东大学 2012
[2]栉孔扇贝抗氧化酶基因的克隆与表达分析[D]. 倪多娇.中国科学院研究生院（海洋研究所） 2007

硕士论文
[1]拟穴青蟹硫氧还蛋白系统及抗氧化相关基因的研究分析[D]. 胡敬环.上海海洋大学 2014



本文编号：2900363