稻瘟病新抗性基因Pi39候选基因CRISPR/Cas9敲除载体的构建

发布时间：2020-12-23 12:18

　　Pi39是位于水稻第12染色体上的稻瘟病新抗性基因,为了明确其功能,本研究利用CRISPR/Cas9系统构建候选基因的敲除载体。通过对候选基因序列分析,将合成的靶位点序列插入入门载体p ENTR-sg RNA,再与表达载体Cas9发生重组。本研究首先在候选基因的第一个外显子区域找到了2个带有PAM序列的靶位点,将2个目的小片段依次克隆到p ENTR-sg RNA载体上。通过菌落PCR检测及测序,结果表明目的小片段插入位置正确。将入门载体与表达载体进行重组反应后,阳性克隆经菌落PCR和质粒DNA酶切鉴定并测序,结果表明重组载体构建成功。本研究利用CRISPR/Cas9系统构建敲除载体操作简单,耗时短,为进一步开展Pi39候选基因的功能研究奠定了基础。 

【文章来源】：中国农学通报. 2016年06期

【文章页数】：5 页

【部分图文】：

表达载体pUbi-Cas9和入门载体pENTR-sgRNA

的引物列表注：引物1和2，3和4互补配对，可形成两对寡核苷酸双链。引物5号可作为正向反应的测序，此外，分别与2号，4号搭配用于PCR扩增。引物序列中下划线部分为酶切位点。克隆命名为pENTR-39C1。2.3第二个编辑位点的插入及阳性克隆鉴定pENTR-39C1克隆鉴定成功后，插入第二个寡核苷酸双链（39CkdBsaⅠF/R二聚体），转化后进行菌落PCR检测，扩增引物为U6F和39CkdBsaⅠR，扩增片段大小为721bp（图3）。测序结果表明片段插入正确，阳性克隆命名为pENTR-39C2。M：DL2000；1：pENTR-sgRNA空载体；2~7：6个单克隆图2pENTR-39C1菌落PCR鉴定图M：DL2000；1：pENTR-sgRNA空载体；2~9：8个单克隆图3pENTR-39C2菌落PCR鉴定图·93·

正向反应的测序，此外，分别与2号，4号搭配用于PCR扩增。引物序列中下划线部分为酶切位点。克隆命名为pENTR-39C1。2.3第二个编辑位点的插入及阳性克隆鉴定pENTR-39C1克隆鉴定成功后，插入第二个寡核苷酸双链（39CkdBsaⅠF/R二聚体），转化后进行菌落PCR检测，扩增引物为U6F和39CkdBsaⅠR，扩增片段大小为721bp（图3）。测序结果表明片段插入正确，阳性克隆命名为pENTR-39C2。M：DL2000；1：pENTR-sgRNA空载体；2~7：6个单克隆图2pENTR-39C1菌落PCR鉴定图M：DL2000；1：pENTR-sgRNA空载体；2~9：8个单克隆图3pENTR-39C2菌落PCR鉴定图·93·

【参考文献】：
期刊论文
[1]CRISPR/Cas9系统介导基因组编辑的研究进展[J]. 刘志国.  畜牧兽医学报. 2014(10)
[2]稻瘟病抗性基因的克隆及应用研究进展[J]. 张佩胜,赵春德,余宁,张迎信,刘群恩.  中国稻米. 2014(05)



本文编号：2933706