沉积微杆菌TPS/TPP基因的克

发布时间：2020-12-28 07:37

　　海藻糖分子是由两个葡糖基以a-1,1糖苷键连接而成,具有优良的生物学性能和食品加工性能,其被广泛应用于食品工业等领域。本实验中,我们对耐压耐冷沉积微杆菌Microbacterium sediminis YLB-01的重组6-磷酸海藻糖合成酶（msTPS）和6-磷酸海藻糖磷酸酯酶（msTPP）的性质进行了一系列的研究。msTPS和msTPP预测分子量分别为55.15kDa和28.59kDa,理论等电点分别为5.89和4.59。我们首先以Microbacterium sediminis YLB-01的TPS和TPP编码基因为依据,分别克隆目的基因,构建重组质粒并将其导入到表达宿主菌体内进行诱导表达,然后通过Ni2+亲和层析、透析及超滤获得较纯浓缩蛋白收集液,最后通过相关实验对其酶学性质做了探究。研究表明：（1）重组-nsTPS最适反应温度和pH分别为40℃和7.5,4℃时依然具有较高的活性,热稳定性较差,Mg2+Co2+或Ba2+能极大的促进其活性,Mn2+、Zn2+、Ca2+和Hg2+对活性没有影响,在本实验条件下对6-磷酸葡萄糖和尿苷二磷酸葡萄糖的Km值分别为1.38mM和1.53mM... 

【文章来源】：福建农林大学福建省

【文章页数】：98 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
    1.1 海藻糖的研究现状概述
        1.1.1 海藻糖的理化性质
        1.1.2 海藻糖在食品加工中的应用
        1.1.3 海藻糖的生产制备
    1.2 6-磷酸海藻糖合成酶研究概述
    1.3 6-磷酸海藻糖磷酸酯酶研究概述
    1.4 msTPS基因生物信息学分析
    1.5 msTPP基因生物信息学分析
    1.6 酶促反应动力学
        1.6.1 底物浓度对酶反应速度的影响
m">        1.6.2 米氏常数Km

        1.6.3 双倒数作图法测定K_m和V_max的值
    1.7 研究意义及内容
        1.7.1 研究意义
        1.7.2 研究内容
第二章 TPS编码基因的克隆、表达及其酶学性质研究
    2.1 实验材料与仪器
        2.1.1 菌株与质粒
        2.1.2 试剂与工具酶
        2.1.3 主要仪器
    2.2 实验方法
        2.2.1 培养基和部分溶液的配置
        2.2.2 菌株在低温、高压条件下的培养
        2.2.3 基因组DNA提取
        2.2.4 msTPS编码基因扩增
        2.2.5 PCR产物的纯化
        2.2.6 载体pET-28a（+）的线性化
        2.2.7 PCR产物与载体pET-28a（+）连接
        2.2.8 E.coli DH5α及E.coli BL21感受态细胞的制备
        2.2.9 重组质粒的转化与阳性克隆子的筛选
        2.2.10 重组菌株构建与蛋白诱导表达
        2.2.11 重组msTPS的分离纯化
        2.2.12 重组msTPS酶活测定方法
        2.2.13 重组msTPS酶学性质研究
    2.3 结果与分析
        2.3.1 基因组DNA的提取
        2.3.2 TPS编码基因的扩增
        2.3.3 PCR产物测序验证及纯化
        2.3.4 载体pET-28a（+）的线性化
        2.3.5 重组质粒TPS@pET-28a的构建
        2.3.6 重组msTPS诱导表达及纯化
        2.3.7 蛋白定量及重组菌株的酶表达量
        2.3.8 重组msTPS酶学性质研究
    2.4 本章小结
第三章 TPP编码基因的克隆、表达及其酶学性质研究
    3.1 实验材料与仪器
        3.1.1 菌株与质粒
        3.1.2 试剂与工具酶
        3.1.3 主要仪器
    3.2 实验方法
        3.2.1 培养基和部分溶液的配置
        3.2.2 菌株在低温、高压条件下的培养
        3.2.3 基因组DNA提取
        3.2.4 msTPP编码基因的扩增
        3.2.5 PCR产物的纯化
        3.2.6 载体pET-28a（+）的线性化
        3.2.7 PCR产物与载体pET-28a（+）的连接
        3.2.8 E.coli DH5α及E.coli BL21感受态细胞的制备
        3.2.9 重组质粒的转化与阳性克隆子的筛选
        3.2.10 重组菌株构建与蛋白诱导表达
        3.2.11 重组msTPP的分离纯化
        3.2.12 重组msTPP酶活测定
        3.2.13 重组msTPP酶学性质研究
    3.3 结果与分析
        3.3.1 基因组DNA的提取
        3.3.2 msTPP编码基因的扩增
        3.3.3 PCR产物验证及纯化
        3.3.4 载体pET-28a（+）的线性化
        3.3.5 重组质粒TPP@pET-28a的构建
        3.3.6 重组msTPP诱导表达及纯化
        3.3.7 蛋白定量及重组菌株的酶表达量
        3.3.8 重组msTPP酶学性质研究
    3.4 本章小结
第四章 总结与展望
    4.1 总结
    4.2 展望
参考文献
致谢
附件
    附件1：msTPS编码基因序列
    附件2：msTPS氨基酸序列
    附件3：msTPP编码基因序列
    附件4：msTPP氨基酸序列


【参考文献】：
期刊论文
[1]改造大肠杆菌合成海藻糖途径以高效合成海藻糖[J]. 高超,张山,何永志,黄健忠,董志扬.  生物工程学报. 2015(12)
[2]海藻糖的性质及应用[J]. 王乃强,张艳君,薛雅莺,栾庆民,杨海军.  精细与专用化学品. 2014(01)
[3]预醒冷冻面团制作及其质量控制[J]. 周家春,包成龙,陈涵,周羽.  食品工业. 2013(09)
[4]海藻糖的加工性能及在食品行业中的应用[J]. 刘红梅.  轻工科技. 2013(08)
[5]海藻糖在焙烤食品中应用研究进展[J]. 王乃强,周清涛,帅斌,王彬彬,杨海军.  食品安全导刊. 2013(05)
[6]响应面法优化食尼古丁节杆菌发酵产海藻糖合成酶的工艺[J]. 张良,肖勇生,包珍,汤峰,刘媛洁,郭德斌.  安徽农业科学. 2012(32)
[7]麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因在巴斯德酵母中的表达及遗传稳定性[J]. 苟兴华,王卫,刘达玉,郭秀兰,张佳敏,唐仁勇,李德华,胡海洋.  应用与环境生物学报. 2010(03)
[8]海藻糖在冷冻猪肉中的应用研究[J]. 李勤,彭亚锋,周家春,薛峰.  食品工业科技. 2009(01)
[9]海藻糖TPS/TPP生物合成途径的进化研究[J]. 杨艳,李增波.  科技情报开发与经济. 2008(16)
[10]海藻糖酶法合成途径及其酶基因的重组表达研究[J]. 李镭,丁宏标,余晓斌,乔宇.  生物技术通报. 2007(03)

硕士论文
[1]海藻糖合酶高产菌株的选育及酶学特性研究[D]. 丁振.山东轻工业学院 2007



本文编号：2943383

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