人原代淋巴细胞CRISPR基因编辑的初步探讨

发布时间：2021-01-06 10:13

　　目的:利用目前高效快捷的CRISPR技术对体外培养的人原代淋巴细胞进行PD-1和CTLA-4基因双敲除方法:一.通过针对CTLA-4基因和PD-1基因各设计了三组候选sgRNA序列,并据此构建CRISPR-CTLA-4和CRISPR-PD-1敲除质粒。使用293淋巴细胞系验证了各个sgRNA的编辑效率。将对CTLA-4和PD-1基因编辑最高的两个sgRNA构建CRISPR-CTLA-4-PD-1双敲除质粒。二.使用电穿孔的方法,尝试将CRISPR-CTLA-4-PD-1双敲除质粒转染到人原代淋巴细胞中。为了达到电穿孔转染原代淋巴细胞的标准,对电穿孔的各种条件进行了摸索与优化。三.利用PCR扩增的方法,从CRISPR-CTLA-4-PD-1双敲除质粒中扩增达到CTLA-4-PD-1片段,将此片段连接到腺病毒表达载体上,以尝试通过构建CRISPR-CTLA-4-PD-1腺病毒感染人原代淋巴细胞。四.利用构建靶向CTLA-4和PD-1基因的CRISPR/RNP蛋白复合物,使用已经优化好的电穿孔条件将其电穿孔转染到人原代淋巴细胞中,并观测转染后基因编辑的情况和改造后淋巴细胞对K562细胞系的杀... 

【文章来源】：广东药科大学广东省

【文章页数】：155 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

pX458质粒提取与酶切Figure2-1pX458plasmidextractionanddigestion

广东药科大学硕士研究生毕业论文M：1kb DNA Marker. 1: PCR 阴性组. 2、3：PD1-1s. 4、5：PD1-2s. 6、7：PD1-3s.8、9：CTLA4-1-1. 10、11：CTLA4-1-2. 12、13：CTLA4-2-1. 分子量单位：bp图 2-2 gRNA 与 pX458 连接转化大肠杆菌后菌液 PCRFigure 2-2 PCR of bacterial cells after gRNA and pX458 were ligated into E.coli如图 2-3 所示，经过分析比对，可以看出构建的六组 sgRNA： CTLA4-1-1,CTLA4-1-2, CTLA4-2-1，PD1-1s, PD1-2s, PD1-3s 已成功插入到 pX458 的酶切位点中，并且已转入到 DH5α中。测序结果与最初设计的 gRNA 序列相同，确定所挑选的单菌落为阳性重组子。可进行下一步的摇菌扩大以及提取去内毒素的质粒。

广东药科大学硕士研究生毕业论文2.3.2.1 去内毒素重组质粒提取将测序验证正确连接的重组大肠杆菌扩大摇菌，摇菌后用 Omega 去内毒素小提质粒试剂盒提取质粒，以备后续转染细胞用。从图 2-4 可以看出提取的质粒主要为超螺旋结构，有少量线性结构，几乎没有检测到开环结构。

【参考文献】：
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本文编号：2960386