低羟基转基因蓖麻新品种的培育及蛋白分析

发布时间：2021-01-11 02:59

　　随着全球环境的不断恶化以及石油能源的日渐枯竭,生物航空燃料因其碳排放量少、可循环再生等特点受到越来越多的关注。本研究以纯系蓖麻为实验材料,通过构建稳定的纯系蓖麻转基因离体再生体系,采用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除蓖麻RcFAH12基因,培育功能缺失突变体。期待获得低羟基蓖麻油酸新品种,使蓖麻基生物航油在工业制备过程中省略脱氧工艺,进而大幅度降低航油制备成本,符合航空产业需求,提高市场应用价值。本文成功克隆了蓖麻RcFAH12基因序列,应用数据库及生物信息学计算分析结果,预测蓖麻油酰12-羟化酶的理化性质、二级结构及互作网络等重要生物学特性,并对基因数据公布序列及五种纯系蓖麻的RcFAH12基因的测序结果进行比对分析。数据分析显示,RcFAH12基因与FAD2、DGAT等多个脂肪酸合成通路中重要的蛋白互作相关,强烈暗示蓖麻RcFAH12基因序列的敲除将引起蓖麻油脂肪酸组分的改变;序列比对结果表明,RcFAH12基因具有高度保守性,为CRISPR/Cas9基因敲除载体特异性识别、剪切提供保证。在实验室已有研究成果的基础上对10种纯系蓖麻品种进行筛选。结果显示,HP003、HP00... 

【文章来源】： 侯宇奇 天津科技大学

【文章页数】：78 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图１－２蓖麻酸甘油酯分子结构式??

后进行琼脂糖凝胶电泳分析。??通过电泳检测及测序比对筛选正确克隆的大肠杆菌菌斑，摇菌抽提重组的终载??体，质粒提取的操作方法同２．２．８。提取的质粒放置于－２０°Ｃ保存备用。??２．７．５?口四８４０１－故‘／＾／／／２－丁３／丁５?载体的构建??该载体的构建使用ＴＩＡＮＧＥＮ公司生产的ＥａｓｙＧｅｎｏ?Ａｓｓｅｍｂｌｙ?Ｃｌｏｎｉｎｇ?ｋｉｔ。反应需??要同时扩增依次具有３０ｂｐ左右重叠序列的目的片段，通过快速同源重组将目的靶点??的核苷酸序列整合至载体骨架。反应原理及载体模式图如图２－２。??Ａ?—＿?＿?Ｂ??Ｍ?ｍ?ｇＲＮＡ?Ｃａｓ９?Ｎｏｓｔｅｒ??一?ＡＩＵ６?＼?＼?＼?Ｈｙｇ??－－?ｘ?Ｔａｒｇｅｔ?＼?３５ｓ?＼ＮＬＳ?＼?ＮＬＳ?＼?３５Ｓ?／??—?Ｉ?Ｉ?—??＇ｖ?Ｖｅｔｌｏｒ?夕??图２－２载体模式图??Ｆｉｇ．?２－２?Ｖｅｃｔｏｒ?ｐａｔｔｅｒｎ??Ａ：同源重组酶原理示意图；Ｂ：?ｐＫ￡Ｓ４０１载体示意图??Ａ：?ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ；?Ｂ：?ｐＫＪＥＳ４０１?ｖｅｃｔｏｒ?ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇｒａｍ??２．７．５．１目的条带的扩増??以ｐＫＥＳ４０ｌ质粒作为模板，进行ＰＣＲ扩增。所用扩增引物及目的片段大小如表??２－所示，。使用ＫＡＰＡ公司的ＫＡＰＡ热启动ＨｉＦｉ高保真酶ＲｅａｄｙＭｉｘ进行ＰＣＲ扩增，??反应体系如表２－所示，延伸时间缩短至４５ｓｅｃ，其余ＰＣＲ反应程序如表２－２８所示。??反应结束后，取２．５?Ｌ的ＰＣＲ产物混合０．５?Ｌ的６ＸＬｏａｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ进

?２材料与方法???ＧｍＵ６?Ｐｒｏｍｏｔｅｒ?１９ｂｐ?Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ?Ｓｅｑｕｅｎｃｅ?ｇＲＮＡ??ＧＴＴＴＡＴＡＴＡＧ?ＣＡＣＣＴＧＧＡＧＡ?ＡＧＧＡＡ丨?义丨ＳＨ?ＮＮＮＮＮＮＭＮＭＭＮＮＮＭＮＮＮＮＮ?ＧＨＩＴＡＧＡＧＣ?ＩＡＧＡＡＡＴＡ６Ｃ?ＡＡＧＴＴＡＡＡＡＩ??ＣＡＡＡＴＡＴＡＴＣ?ＧＴＧＧＡＣＣＴＣＴ?ＴＣＣＴＴＡＣ?ＣＡ?Ａ?ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＷＮＮ?ＡＴＣＴＣＧ?ＡＴＣＴＴＴＡＴＣＧ?ＴＴＣＡＡＴＴＴＴＡ??图２－３载体模式图??Ｆｉｇ．?２－３?Ｖｅｃｔｏｒ?ｐａｔｔｅｒｎ??２．７．７农杆菌侵染工程菌株的制备??使用委托杭州百格生物技术有限公司构建的ｐＢＧＫ０４１－／？ｃＥ４／／７２－Ｔ３基因敲除载体??和自我构建的?ｐＣＡＭＢＩＡ?１３００－ＲｃＦＡＨ１２－Ｔ３／Ｔ５?及?ｐＫＥＳ４０Ｗ化抑＂７２－丁３／丁５?基因敲除??载体，转化至农杆菌ＬＢＡ４４０４．实验方法如２．３．１。挑选菌斑形态良好的菌斑进行菌斑??ＰＣＲ检测，操作同２．２．７。鉴定阳性菌斑后挑斑至含有相应抗生素的ＬＢ液体培养基中，??２８°Ｃ过夜振荡培养。最后保菌并放置于－８０°Ｃ备用，处理办法如２．２．８所述。??２．８低羟基转基因蓖麻的培育??按照２．５中优化的蓖麻遗传转化体系继续培育蓖麻新品种，使用２．７．７制备的三种??农杆菌侵染工程菌株侵染蓖麻外植体，期待获得具有低羟基转基因蓖麻表型的蓖麻油??酰１２－羟化酶功能缺失型突变体，为基因编辑技术在蓖麻领域的应用以及蓖麻分子育??种方向带来新的成果。??３６??


本文编号：2969943