利用CRISPR/Cas9全基因组敲除技术筛选神经细胞低氧耐受基因
发布时间：2021-01-16 00:09
研究背景和目的低氧环境是地球上生物面临的极端环境之一,包括高纬度低氧环境如中国的青藏高原,地下以及洞穴低氧环境,和水生哺乳动物面临的周期性低氧环境等。长期低氧会导致机体在生理和病理上产生一系列不良反应,严重时还会导致许多疾病发生,如肺纤维化,哮喘,心脑血管疾病等。而在人体的所有器官中大脑的神经元对低氧的耐受性是最低的,因为脑组织的能量几乎全部都来自于有氧代谢,几乎没有无氧代谢。近些年来,CRISPR/Cas9基因编辑技术因为其易操作,效率高已广泛地应用在多个生物科学领域,并且它作为一种高通量研究基因功能的工具使得从全基因组层面上研究基因对特定细胞表型的贡献成为可能。所以在这一背景下,我们想通过CRISPR/Cas9全基因组文库筛选技术在神经细胞中找到一些新的低氧耐受基因。研究方法和结论本研究首先在小鼠神经瘤母细胞细胞系N2a上优化了小鼠全基因组敲除文库的慢病毒文库感染体系,然后构建了包含全基因组文库的稳转细胞株,将其低氧处理后收集活细胞进行富集,通过优化测序建库方法后将富集的细胞进行二代测序,在得到数据后利用生物信息学分析样本之间的相关性,后进行样本中基因数和sgRNA数目的认证,接下...
【文章来源】：苏州大学江苏省
【文章页数】：69 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图２－１．实验流程图
）；??磁珠法动物组织基因组ＤＮＡ提取试剂盒（ＤＰ３４１－０２，天根，中国）；??２．２．２实验方法??１．?ＧｅＣＫＯｖ２ｓｇＲＮＡ文库准备：最初的文库由焦保卫教授实验室提供，后面??根据焦保卫老师实验室提供的扩大文库的步骤进行我们自己文库的扩大培养［３０］。??Ｓｉｎｇｌｅ－ｖｅｃｔｏｒ?ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ?ＧｅＣＫＯ?ｓｙｓｔｅｍ??ｃＰＰＴ??ｐｓｉ＋?ＲＲＥ?Ｕ６?ｓｇＲＮＡ?ＥＦＳ?ＳｐＣａｓ９?Ｆｌａｇ?Ｐ２ＡＰｕｒｏ?ＷＰＲＥ??ｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲｖ２??图２－２．优化后的病毒载体丨２９丨。??Ｆｉｇｕｒｅ?２－２．?Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ?ｖｉｒｕｓ?ｖｅｃｔｏｒ．??具体步骤如下：??９??
下整个筛选实验的流程：在拿到小鼠ＣＲＩＳＰＲ全基因组敲除文库??之后，进行文库的扩大培养之后用来感染目的细胞系（小鼠神经瘤母细胞），在经??过多次实验摸索之后确定感染条件保证绝大部分细胞每个细胞只感染一条??ｓｇＲＮＡ，构建好目的细胞系的稳转细胞株后，放在１％的低氧环境下分别处理７２??小时和９６小时，不适应这种环境的细胞就会死掉，而活下来的细胞里面可能就存??在较为感兴趣的基因。再将这些细胞富集到一定数量时，提取其基因组ＤＮＡ，扩??增出ｓｇＲＮＡ片段之后送去测序，后进行数据分析。图２－３为整个实验设计的流程??图［３１］：??Ｐｏｓｉｔｉｖｅ?ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ：?Ｎｅｇａｔｉｖｅ?ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ：??—７Ｔ＼?ｆ￣ｒ＼—＾?ｒ＊ｖ?Ｉ?ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ?ｏｆ?ｃｌｏｎｅｓ?ｌｏｓｓ?ｏｆ?ｅｓｓｅｎｔｉａｌ?ｇｅｎｅｓ??圓？國？國？圍??ｌ．Ｏｌｉｇｏ?２．Ｐｌａｓｍｉｄ?３．Ｖｉｒｕｓ?々．Ｉｎｔｒｏｄｕｃｅ?＼＿ｙ??ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ?ｐｏｏｌ?ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ?ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎｓ?Ｓ．Ｃｏｎｄｕｃｔ?ａ?ｓｃｒｅｅｎ?ｗｉｔｈ?ｐｏｓｉｔｉｖｅ??ｔｏ?ｃｅｌｌｓ?ｏｒ?ｎｅｇａｔｉｖｅ?ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ??ｓｇＲＮＡ?丨ｎｉｔ．?Ｐｏｓ．?Ｎｅｇ．???????１６?０?０?？？？？？？？？?Ｎ?？?￣￣??￣＾￣＾￣ｇＤＮＡ－ｖｅｃｔｏｒ－ｓｇＲＮＡ－ｖｅｃｔｏｒ－ｇＤＮＡ??—１７?〇—＾—??丨?■?■—?７．Ｎｅｘｔ?ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ?６．ＰＣＲ?ｇｅｎｏｍｉｃ?ＤＮＡ??８．Ｍａｔｒｉｘ?ｏｆ?ｓｇＲ
【参考文献】：
期刊论文
[1]基于CRISPR/Cas9技术的高通量筛选平台:发掘病毒复制相关宿主分子的新途径[J]. 王文静,李素,肖书奇,仇华吉. 微生物学报. 2018(11)
[2]CRISPR系统的优势与瑕疵[J]. 李丹丹,林峻. 生物化工. 2017(02)
[3]CRISPR/Cas9系统在水稻基因组编辑中的应用[J]. 唐秀英,王会民,龙起樟,黄永兰,芦明,万建林. 分子植物育种. 2017(03)
[4]提高CRISPR/Cas9系统靶向编辑效率方法的研究进展[J]. 赵盼盼,王丽,袁园园,常卫东,王林嵩. 江苏农业科学. 2017(01)
[5]CRISPR/Cas9-sgRNA全基因组文库筛选人单核细胞白血病功能性促癌/抑癌基因体系的建立与优化[J]. 陈晨,郝莎,白杨,张健萍,张孝兵,程涛. 中国科学:生命科学. 2016(07)
[6]CRISPR/Cas9基因组编辑技术的研究进展及其应用[J]. 蒲强,罗嘉,沈林園,李强,张谊,张顺华,朱砺. 中国生物工程杂志. 2015(11)
本文编号：2979767
【文章来源】：苏州大学江苏省
【文章页数】：69 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图２－１．实验流程图
）；??磁珠法动物组织基因组ＤＮＡ提取试剂盒（ＤＰ３４１－０２，天根，中国）；??２．２．２实验方法??１．?ＧｅＣＫＯｖ２ｓｇＲＮＡ文库准备：最初的文库由焦保卫教授实验室提供，后面??根据焦保卫老师实验室提供的扩大文库的步骤进行我们自己文库的扩大培养［３０］。??Ｓｉｎｇｌｅ－ｖｅｃｔｏｒ?ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ?ＧｅＣＫＯ?ｓｙｓｔｅｍ??ｃＰＰＴ??ｐｓｉ＋?ＲＲＥ?Ｕ６?ｓｇＲＮＡ?ＥＦＳ?ＳｐＣａｓ９?Ｆｌａｇ?Ｐ２ＡＰｕｒｏ?ＷＰＲＥ??ｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲｖ２??图２－２．优化后的病毒载体丨２９丨。??Ｆｉｇｕｒｅ?２－２．?Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ?ｖｉｒｕｓ?ｖｅｃｔｏｒ．??具体步骤如下：??９??
下整个筛选实验的流程：在拿到小鼠ＣＲＩＳＰＲ全基因组敲除文库??之后，进行文库的扩大培养之后用来感染目的细胞系（小鼠神经瘤母细胞），在经??过多次实验摸索之后确定感染条件保证绝大部分细胞每个细胞只感染一条??ｓｇＲＮＡ，构建好目的细胞系的稳转细胞株后，放在１％的低氧环境下分别处理７２??小时和９６小时，不适应这种环境的细胞就会死掉，而活下来的细胞里面可能就存??在较为感兴趣的基因。再将这些细胞富集到一定数量时，提取其基因组ＤＮＡ，扩??增出ｓｇＲＮＡ片段之后送去测序，后进行数据分析。图２－３为整个实验设计的流程??图［３１］：??Ｐｏｓｉｔｉｖｅ?ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ：?Ｎｅｇａｔｉｖｅ?ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ：??—７Ｔ＼?ｆ￣ｒ＼—＾?ｒ＊ｖ?Ｉ?ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ?ｏｆ?ｃｌｏｎｅｓ?ｌｏｓｓ?ｏｆ?ｅｓｓｅｎｔｉａｌ?ｇｅｎｅｓ??圓？國？國？圍??ｌ．Ｏｌｉｇｏ?２．Ｐｌａｓｍｉｄ?３．Ｖｉｒｕｓ?々．Ｉｎｔｒｏｄｕｃｅ?＼＿ｙ??ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ?ｐｏｏｌ?ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ?ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎｓ?Ｓ．Ｃｏｎｄｕｃｔ?ａ?ｓｃｒｅｅｎ?ｗｉｔｈ?ｐｏｓｉｔｉｖｅ??ｔｏ?ｃｅｌｌｓ?ｏｒ?ｎｅｇａｔｉｖｅ?ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ??ｓｇＲＮＡ?丨ｎｉｔ．?Ｐｏｓ．?Ｎｅｇ．???????１６?０?０?？？？？？？？？?Ｎ?？?￣￣??￣＾￣＾￣ｇＤＮＡ－ｖｅｃｔｏｒ－ｓｇＲＮＡ－ｖｅｃｔｏｒ－ｇＤＮＡ??—１７?〇—＾—??丨?■?■—?７．Ｎｅｘｔ?ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ?６．ＰＣＲ?ｇｅｎｏｍｉｃ?ＤＮＡ??８．Ｍａｔｒｉｘ?ｏｆ?ｓｇＲ
【参考文献】：
期刊论文
[1]基于CRISPR/Cas9技术的高通量筛选平台:发掘病毒复制相关宿主分子的新途径[J]. 王文静,李素,肖书奇,仇华吉. 微生物学报. 2018(11)
[2]CRISPR系统的优势与瑕疵[J]. 李丹丹,林峻. 生物化工. 2017(02)
[3]CRISPR/Cas9系统在水稻基因组编辑中的应用[J]. 唐秀英,王会民,龙起樟,黄永兰,芦明,万建林. 分子植物育种. 2017(03)
[4]提高CRISPR/Cas9系统靶向编辑效率方法的研究进展[J]. 赵盼盼,王丽,袁园园,常卫东,王林嵩. 江苏农业科学. 2017(01)
[5]CRISPR/Cas9-sgRNA全基因组文库筛选人单核细胞白血病功能性促癌/抑癌基因体系的建立与优化[J]. 陈晨,郝莎,白杨,张健萍,张孝兵,程涛. 中国科学:生命科学. 2016(07)
[6]CRISPR/Cas9基因组编辑技术的研究进展及其应用[J]. 蒲强,罗嘉,沈林園,李强,张谊,张顺华,朱砺. 中国生物工程杂志. 2015(11)
本文编号：2979767
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/jiyingongcheng/2979767.html
最近更新
教材专著
