SPAG6基因沉默对SKM-1细胞凋亡的调控作用及机制研究

发布时间：2021-01-16 13:18

　　目的:利用pGC-SPAG6-shRNA重组慢病毒载体在MDS细胞中靶向沉默SPAG6基因,明确SPAG6表达差异与PTEN的关系,从体内体外两方面探究SPAG6是否通过PI3K/AKT信号通路调控骨髓增生异常综合征（MDS）细胞凋亡,为MDS治疗探索新的靶点。方法:1.构建SPAG6-/-型SKM-1细胞模型:利用SPAG6-shRNA及NC-shRNA重组慢病毒载体,转染人MDS细胞株SKM-1细胞,流式细胞术检测病毒转染效率,荧光显微镜下观察细胞荧光表达,qRT-PCR检测mRNA表达水平,Western blot检测蛋白表达水平。2.探讨SPAG6在MDS细胞中对PTEN/PI3K/AKT信号通路活化的影响。流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测PTEN/PI3K/AKT通路相关蛋白表达。随后,利用PI3K/AKT抑制剂（Ly294002）和Caspase抑制剂（z-VAD-fmk）作用转染慢病毒的SKM-1细胞,Western blot检测PI3K/AKT通路相关凋亡蛋白表达。3.探索SPAG6在体内对MDS细胞凋亡的影响及机制:构建MDS荷瘤小鼠模型,检测小鼠... 

【文章来源】：重庆医科大学重庆市

【文章页数】：55 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图２：干扰ＳＰＡＧ６表达后，细胞凋亡增加??－

中的ｃａｓｐａｓｅ－８表达无明显变化，无统计学差异（ｐ＞０．０５），说明ｃａｓｐａｓｅ成功被抑??制。此时检测ＰＴＥＮ的表达，发现ＰＴＥＮ的活化并不受影响，同时凋亡通路中??ｃａｓｐａｓｅ－９及ｃａｓｐａｓｅ－３的表达增加（ｐ＜０．０５，图６Ａ和Ｂ）。由此说明干扰ＳＰＡＧ６??表达后

直至组织完全裂解。提取组织蛋白，进行相关蛋白检测。结果显示，干扰组中ＰＴＥＮ??蛋白表达增加，ＡＫＴ和Ｂｃｌ－２表达下降，细胞色素ｃ表达增加，与体外结果一致??（图８）。表明ＳＰＡＧ６在体内可通过ＰＴＥＮ调控细胞内源通路诱导细胞凋亡。??Ａ??３?ｂ??＾?□?ＮＣ－ｓｈＲＮＡ??＾?＾－?ＳＰＡＧ６（５０ｋＤａ）?｜?２?°１?■?ＳＰＡＧ６－ｓ＿Ａ??＿?＿—?ｌ?＾??？?－?ｍｍｍ?ＰＴＥＮ（５５ｋＤａ）?Ｉ?１５＇??｜?ＡＫＴ（６０ｋＤａ）?｜?ｉ?Ｊ?料??．?Ｂｃｌ－２（２２ｋＤａ）?０．５－?Ｉ?ｒ＾ｌ?■??—ｊ?ＣｙｔｏＣ（１５ｋＤａ）?ｇ?，，０．１ＬＰ－ＬＰ?１?Ｐ?Ｉ?｜ｌ?Ｉ?Ｐ??ＧＡＰＤＨ（３６ｋＤａ）??图８：干扰ＳＰＡＧ６表达后组织相关凋亡蛋白的表达??Ｆｉｇｕｒｅ?８：?Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ?ｏｆ?ＳＰＡＧ６?ｉｎｄｕｃｅｄ?ｒｅｌａｔｉｖｅ?ａｐｏｐｔｏｓｉｓ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｏｆ?ｔｕｍｏｒ?ｃｅｌｌｓ??（Ａ）?Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｆｏｒ?ｔｈｅ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｏｆ?ＳＰＡＧ６，?ＰＴＥＮ，?ＡＫＴ，?ＢＣＬ－２，?ａｎｄ?ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ??ｃ?ｉｎ?ｔｕｍｏｒ?ｔｉｓｓｕｅｓ?ｆｒｏｍ?ｍｉｃｅ?ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ?ｗｉｔｈ?ＳＫＭ－１?ｃｅｌｌｓ?ｔｈａｔ?ｗｅｒｅ?ｐｒｅ－ｉｎｆｅｃｔｅｄ?ｗｉｔｈ??ＳＰＡＧ６－ｔａｇｅｔｉｎｇ?ｓｈＲＮＡ?ｏｒ?ｃｏｎｔｒｏｌ?ｓｈＲＮＡ?ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ．?ＧＡＰＤＨ?ｗａｓ?ｕｓｅｄ?ａｓ?ａ?ｌｏａｄｉｎｇ?ｃｏｎｔｒｏｌ．??Ｌａｎｅ?ａ

【参考文献】：
期刊论文
[1]A Zebrafish Model of 5q-Syndrome Using CRISPR/Cas9 Targeting RPS14 Reveals a p53-Independent and p53-Dependent Mechanism of Erythroid Failure[J]. Jason Ear,Jessica Hsueh,Melinda Nguyen,QingHua Zhang,Victoria Sung,Rajesh Chopra,Kathleen M.Sakamoto,Shuo Lin.  Journal of Genetics and Genomics. 2016(05)



本文编号：2980900