Microbulbifer sp.A4B-17菌株的DAHP合酶基因研究

发布时间：2021-01-19 00:32

　　用途广泛的对羟基苯甲酸（4HBA）,是一种有机合成原料,普遍应用于食品、化妆品、液晶制品、杀菌剂等领域。从石油成分中化学合成会带来环境污染问题;利用植物中合成的4HBA会被酯化;利用重组大肠杆菌合成4HBA有产量问题。本实验室从海洋环境中收集分离出20多株Microbulbifer属的菌株,发现它们都合成积累4HBA和4HBA酯类等次级代谢产物,其中A4B-17菌株的合成量最多。我们已经完成了A4B-17菌株的基因组测序和注释等工作,通过对该菌株的深入研究一方面可以克服以前生产方式的弊端,另一方面可以从可再生资源合成4HBA等工业原料。本研究针对A4B-17菌株合成对羟基苯甲酸途径中的一个反应做了深入研究。该反应是磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和4-磷酸赤藓糖（E4P）的缩合反应,在3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸（DHAP）合酶的作用下生成DHAP。A4B-17菌株的基因组上有三个基因编码DHAP合酶,基因编号分别为GM002069、GM001679、GM001835。本研究对这三个基因在大肠杆菌中高效表达后,进行了酶的性质研究。采用pCold IV载体对基因进行表达,检测方法为高效... 

【文章来源】：江苏师范大学江苏省

【文章页数】：120 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 引言
    1.1 选题依据
    1.2 对羟基苯甲酸的合成现状
    1.3 微泡菌Microbulbifersp.A4B?17菌株
    1.4 DAHP合酶
    1.5 蛋白的表达与纯化
    1.6 研究内容及意义
    1.7 基因分析
第二章 DAHP合酶基因GM002069的克隆与表达
    2.1 实验材料与方法
        2.1.1 使用菌株
        2.1.2 培养基
        2.1.3 主要仪器设备
        2.1.4 质粒提取试剂
        2.1.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂
        2.1.6 其他试剂
        2.1.7 PCR反应体系与条件
        2.1.8 核酸琼脂糖凝胶电泳
        2.1.9 质粒的提取
        2.1.10 感受态细胞的制备
        2.1.11 质粒载体的酶切体系
        2.1.12 粗酶的提取
        2.1.13 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
        2.1.14 层析
    2.2 表达质粒pColdI-GM002069结果
        2.2.1 目的基因的克隆
        2.2.2 基因表达
        2.2.3 蛋白定量
        2.2.4 蛋白纯化
        2.2.5 硫代巴比妥酸法酶活测定
    2.3 表达质粒pColdIV-GM002069结果与讨论
        2.3.1 目的基因的克隆
        2.3.2 基因表达
        2.3.3 高效液相色谱法I酶活验证
        2.3.4 不同条件下的酶活曲线
    2.4 表达质粒pET-21a（+）-GM002069结果与讨论
        2.4.1 目的基因的克隆
        2.4.2 基因表达
        2.4.3 高效液相色谱法II酶活验证
        2.4.4 反馈调控
        2.4.5 本章小结
第三章 DAHP合酶基因GM001679的克隆与表达
    3.1 实验材料与方法
        3.1.1 使用菌株
        3.1.2 主要仪器设备
        3.1.3 PCR反应体系与条件
        3.1.4 质粒的提取
        3.1.5 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
        3.1.6 蛋白含量测定
        3.1.7 DAHP合酶活性测定
        3.1.8 高效液相色谱的使用
    3.2 表达质粒pColdI-GM001679结果与讨论
        3.2.1 目的基因的克隆
        3.2.2 基因表达
        3.2.3 蛋白定量
        3.2.4 硫代巴比妥酸法酶活测定
    3.3 表达质粒pColdIV-GM001679结果与讨论
        3.3.1 目的基因的克隆
        3.3.2 基因表达
        3.3.3 高效液相色谱法I酶活测定
        3.3.4 不同条件下的酶活曲线
        3.3.5 反馈调控
    3.4 表达质粒pET-21a（+）-GM001679结果与讨论
        3.4.1 目的基因的克隆
        3.4.2 基因表达
        3.4.3 酶活验证
        3.4.4 反馈调控
        3.4.5 本章小结
第四章 GM001835基因DAHP合酶的克隆与表达
    4.1 实验材料与方法
        4.1.1 使用菌株
        4.1.2 主要仪器设备
        4.1.3 使用试剂
        4.1.4 PCR反应体系与条件
        4.1.5 核酸琼脂糖凝胶电泳
        4.1.6 质粒的提取注意事项
        4.1.7 质粒载体的酶切体系
        4.1.8 粗酶的提取
        4.1.9 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
    4.2 表达载体pColdIV-GM001835结果与讨论
        4.2.1 目的基因的克隆
        4.2.2 基因表达
        4.2.3 高效液相色谱法酶活测定
        4.2.4 不同条件下的酶活曲线
        4.2.5 反馈调控
总结与展望
附录
参考文献
致谢
作者简历
学位论文数据集



本文编号：2985971