炭团木霉中非核糖体多肽基因NRPS1的功能研究
发布时间：2021-01-19 05:13
【目的】木霉属真菌是应用最为广泛和潜力最大的生防真菌,其产生的典型化合物哌珀霉素（peptaibols）类抗生素在生物防治中发挥重要作用。本研究采用基因组挖掘技术（genome mining）发现炭团木霉（Trichoderma hypoxylon）的潜在哌珀霉素生物合成基因簇及对病原菌的防治作用。【方法】生物信息学分析预测合成哌珀霉素的基因簇,利用Quick-change技术构建基因骨架敲除盒,通过PEG介导的原生质体转化方法获得敲除突变株,通过平板对峙法和菌丝生长毒力实验验证该基因簇对炭团木霉生物活性的影响。【结果】基因挖掘鉴定一个非核糖体多肽合成酶（nonribosomal peptide synthetases,NRPS）可能合成哌珀霉素类抗生素,命名为NRPS1,对该基因进行部分敲除,成功获得3株NRPS1缺失突变株。对峙实验表明,突变株对寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、黑白轮枝菌（Verticillium alboatrum）等9株植物病原真菌的抑制作用与野生株相比显著下降,且突变株的粗提物的抑...
【文章来源】：微生物学报. 2020,60(10)北大核心
【文章页数】：12 页
【部分图文】：
炭团木霉中NRPS1基因簇生物信息学分析
哌珀霉素是一类主要由木霉属真菌产生的典型活性化合物，其化学结构具有典型的特征，即N端富含非天然氨基酸α-氨基异丁酸(α-aminoisobutyric acid,Aib),C末端会常常被羟基化成氨基醇(alcohol)的肽(peptide)类抗生素[14–16]。哌珀霉素的主要长度在5–20个氨基酸之间，多数含有15–20个氨基酸残基[17–18]。迄今为止，已鉴定的哌珀霉素类化合物超过300个[19]，随着越来越多的哌珀霉素被发现，这类特殊化合物的生物合成和功能研究也逐渐成为焦点。2002年，Wiest等从绿木霉(T.virens)中鉴定并克隆了第一个哌珀霉素合成酶基因tex1，该基因由18个完整的最小模块(A-T-C,adenylation-thiolation-condensation，腺苷酰化结构域-巯基化结构域-缩合结构域)组成，每个模块序列之间的同源性达到35%–58%[20]。其中腺苷酰化结构域(adenylation,A-domain)的差异决定了对底物的选择性不同，进而导致化合物结构多样性，也决定了该类化合物对革兰氏阳性菌、阴性菌、真菌、螺原体和病毒等活性的不同[13–14]。哌珀霉素抗菌的作用机制是复杂的，目前的研究主要集中于其穿膜时三维构象的差异，其作用机制主要有“桶-板”模型(barrel-stave model)、“毯式”模型(carpet model)、“虫孔”模型(toroidal pore model)等。最广为接受的机制是Ehrenstein等在1977年提出的“桶-板”模型，认为哌珀霉素以多聚体的形式插入细胞膜双分子层，形成跨膜的离子通道，破坏细胞膜的完整性，干扰细胞正常的代谢，从而导致细胞的死亡而达到杀菌的目的[15,21]。哌珀霉素区别于其他抗生素的作用机制使其具有广谱的抗微生物活性，且不易使病原微生物产生抗药性。本研究中使用的炭团木霉菌株是2016年从Hypoxylon anthochroum中分离得到的[6]，在前期的工作中已建立了该菌高效的遗传操作体系[22]。鉴于其丰富的次级代谢产物，对其生物学功能的研究具有重要理论意义。通过基因挖掘策略，对炭团木霉基因组进行生物信息学分析，发现了一个含有19个A-T-C模块的NRPS1，且该序列在不同木霉中均保守。通过与已知哌珀霉素的生物合成基因进行序列比对，预测NRPS1可能是合成哌珀霉素类化合物的核心基因。通过PEG介导的原生质体转化的方法获得NRPS1缺失株，并研究了炭团木霉野生型与突变株的活性差异。证明了该基因在炭团木霉生防过程中发挥重要作用，为该菌的后续研究提供了方向，为其生防应用奠定了基础。
图2.炭团木霉中NRPS1基因簇生物信息学分析将炭团木霉WT和TYHL3在PDA培养基上培养7 d，用乙酸乙酯萃取菌丝及培养基，利用高效液相色谱法(HPLC)分析对次级代谢产物进行分析，分析结果如图3-C所示。在210 nm波长下，野生型中保留时间为20.2 min的代谢产物峰在NRPS1基因缺失后消失，推测该峰为炭团木霉哌珀霉素类化合物的代谢产物峰，NRPS1基因为哌珀霉素类化合物的生物合成基因。
【参考文献】：
期刊论文
[1]后基因组时代的真菌天然产物发现[J]. 李伟,吴广畏,杨玉萍,尹文兵. 菌物学报. 2015(05)
[2]木霉属研究概况[J]. 朱兆香,庄文颖. 菌物学报. 2014(06)
[3]木霉peptaibols抗菌肽的研究进展[J]. 宋晓妍,张玉忠,王元秀. 微生物学报. 2011(04)
本文编号：2986402
【文章来源】：微生物学报. 2020,60(10)北大核心
【文章页数】：12 页
【部分图文】：
炭团木霉中NRPS1基因簇生物信息学分析
哌珀霉素是一类主要由木霉属真菌产生的典型活性化合物，其化学结构具有典型的特征，即N端富含非天然氨基酸α-氨基异丁酸(α-aminoisobutyric acid,Aib),C末端会常常被羟基化成氨基醇(alcohol)的肽(peptide)类抗生素[14–16]。哌珀霉素的主要长度在5–20个氨基酸之间，多数含有15–20个氨基酸残基[17–18]。迄今为止，已鉴定的哌珀霉素类化合物超过300个[19]，随着越来越多的哌珀霉素被发现，这类特殊化合物的生物合成和功能研究也逐渐成为焦点。2002年，Wiest等从绿木霉(T.virens)中鉴定并克隆了第一个哌珀霉素合成酶基因tex1，该基因由18个完整的最小模块(A-T-C,adenylation-thiolation-condensation，腺苷酰化结构域-巯基化结构域-缩合结构域)组成，每个模块序列之间的同源性达到35%–58%[20]。其中腺苷酰化结构域(adenylation,A-domain)的差异决定了对底物的选择性不同，进而导致化合物结构多样性，也决定了该类化合物对革兰氏阳性菌、阴性菌、真菌、螺原体和病毒等活性的不同[13–14]。哌珀霉素抗菌的作用机制是复杂的，目前的研究主要集中于其穿膜时三维构象的差异，其作用机制主要有“桶-板”模型(barrel-stave model)、“毯式”模型(carpet model)、“虫孔”模型(toroidal pore model)等。最广为接受的机制是Ehrenstein等在1977年提出的“桶-板”模型，认为哌珀霉素以多聚体的形式插入细胞膜双分子层，形成跨膜的离子通道，破坏细胞膜的完整性，干扰细胞正常的代谢，从而导致细胞的死亡而达到杀菌的目的[15,21]。哌珀霉素区别于其他抗生素的作用机制使其具有广谱的抗微生物活性，且不易使病原微生物产生抗药性。本研究中使用的炭团木霉菌株是2016年从Hypoxylon anthochroum中分离得到的[6]，在前期的工作中已建立了该菌高效的遗传操作体系[22]。鉴于其丰富的次级代谢产物，对其生物学功能的研究具有重要理论意义。通过基因挖掘策略，对炭团木霉基因组进行生物信息学分析，发现了一个含有19个A-T-C模块的NRPS1，且该序列在不同木霉中均保守。通过与已知哌珀霉素的生物合成基因进行序列比对，预测NRPS1可能是合成哌珀霉素类化合物的核心基因。通过PEG介导的原生质体转化的方法获得NRPS1缺失株，并研究了炭团木霉野生型与突变株的活性差异。证明了该基因在炭团木霉生防过程中发挥重要作用，为该菌的后续研究提供了方向，为其生防应用奠定了基础。
图2.炭团木霉中NRPS1基因簇生物信息学分析将炭团木霉WT和TYHL3在PDA培养基上培养7 d，用乙酸乙酯萃取菌丝及培养基，利用高效液相色谱法(HPLC)分析对次级代谢产物进行分析，分析结果如图3-C所示。在210 nm波长下，野生型中保留时间为20.2 min的代谢产物峰在NRPS1基因缺失后消失，推测该峰为炭团木霉哌珀霉素类化合物的代谢产物峰，NRPS1基因为哌珀霉素类化合物的生物合成基因。
【参考文献】：
期刊论文
[1]后基因组时代的真菌天然产物发现[J]. 李伟,吴广畏,杨玉萍,尹文兵. 菌物学报. 2015(05)
[2]木霉属研究概况[J]. 朱兆香,庄文颖. 菌物学报. 2014(06)
[3]木霉peptaibols抗菌肽的研究进展[J]. 宋晓妍,张玉忠,王元秀. 微生物学报. 2011(04)
本文编号：2986402
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