基于crispr/cas9的大肠杆菌基因编辑方法研究

发布时间：2021-01-20 16:13

　　尽管CRISPR/Cas9系统是一个强大的、不可思议的基因组编辑工具,但人们在实际应用中还是发现其并不是没有缺陷。对于PAM-free和CRISPR受限制的区域,当下通常使用的CRISPR/Cas9系统都不能有效的编辑,而其较高的脱靶几率则使其不能得到更广泛的应用。为了改进这些缺陷,我们开发了一个非常简单的基于CRISPR/cas9的无质粒一步法（CAGO）基因组编辑技术,它不需要构建一个来表达特定的gRNA的质粒。而是通过构建一个具有极高靶向效率的通用N20序列,以同源重组的方式插入到大肠杆菌的染色体中,然后诱导CRISPR/Cas9在通用N20序列处切割双链DNA造成染色体双链断裂,再诱导染色体重组修复以完成编辑过程。实验已证明这一技术能够没有任何副作用的编辑CRISPR受限制的DNA区域。当应用到多位点编辑时,CAGO可以在两天内以几乎100%的编辑效率编辑一个靶目标。此外,稍微调整后的CAGO能够用于编辑多达100kbp的大片段区域,编辑效率达到75%。最后,在CAGO的基因组编辑方法构建中,通过应用模块化的设计策略,进一步简化了供体DNA线性片段的转换过程和构建。虽然该技术是... 

【文章来源】：西华师范大学四川省

【文章页数】：54 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

PAM-free示意图

图 2-1 part A 和线性目标载体的 Golden Gate 装配Fig. 2-1 Golden Gate assembly of partA with a linearized destination v

CAGO编辑片段的构建Figure2-2.ConstructionofeditfragmentsofCAGO.

【参考文献】：
期刊论文
[1]2017合成生物学专刊序言[J]. 张先恩.  生物工程学报. 2017(03)
[2]合成生物学技术的研究进展——DNA合成、组装与基因组编辑[J]. 李诗渊,赵国屏,王金.  生物工程学报. 2017(03)
[3]天然产物合成生物学关键技术[J]. 匡雪君,邹丽秋,李滢,孙超,陈士林.  中国中药杂志. 2016(22)
[4]人工核酸内切酶介导的新一代基因组编辑技术进展[J]. 肖安,张博.  生物工程学报. 2015(06)
[5]基因组编辑[J]. 克里斯蒂娜·拉尔森,威阿曼达·谢弗.  科技创业. 2014(05)
[6]TALENs:一种新的基因定点修饰技术[J]. 张金脉,任兆瑞.  生命科学. 2013(01)
[7]曲霉菌细胞工厂的现状及前景[J]. 顾丰颖,高洁,何国庆.  食品工业科技. 2012(23)
[8]制备高效大肠杆菌电转化感受态细胞和电转化条件的研究[J]. 朱森康,黄磊,李燕飞,钟卫鸿,徐志南.  生物技术通报. 2011(10)
[9]应用基因组工程构建新型大肠杆菌细胞工厂[J]. 蔡钒,方宏清,陈必链.  生命科学. 2011(09)
[10]生物炼制细胞工厂:生物制造的技术核心[J]. 马延和.  生物工程学报. 2010(10)

博士论文
[1]植物合成生物学工具箱的优化及其在基因组编辑中的应用研究[D]. 张海艳.中国农业大学 2017

硕士论文
[1]基于CRISPR-Cas9系统的谷氨酸棒状杆菌基因组编辑技术的研究[D]. 靳海迎.山东大学 2017
[2]CRISPR/Cas9与ZFNs 介导牛MSTN位点基因打靶效率的比较研究[D]. 刘慧.内蒙古大学 2015
[3]代谢网络端通路计算方法的研究[D]. 王英.复旦大学 2012
[4]抑癌基因PTEN在同源重组修复及其敲除对Rad51基因表达的影响及机制研究[D]. 莫琳.重庆医科大学 2009



本文编号：2989359