维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统及其基因编辑方法

发布时间：2017-04-11 12:23

  本文关键词：维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统及其基因编辑方法，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：在细菌以及古细菌中广泛存在规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR, clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)系统,是细菌在长期进化过程中形成的由RNA介导降解入侵菌体的噬菌体等外源核酸的适应性免疫系统。近年来研究表明,CRISPR系统可以很好地被改造成基因编辑工具。通过设计引导RNA招募Cas蛋白对靶位点进行识别切割,激活菌体内部的同源重组(Homologous recombination, HR)修复机制,与设计好的编辑模板进行交换以实现基因编辑。维吉尼亚链霉菌IBL14 (Streptomyces virginiae IBL14)是本实验室从制药厂附近的活性泥污中分离得到的一株能降解多种甾体化合物的放线菌。本研究通过对IBL14的全基因组序列进行比对,发现在IBL14中也存在CRISPR系统。其中存在18个CRISPR位点,其中3个是确定的位点,其他都是有疑问的位点。通过蛋白比对发现在SV01和SV02两个CRISPR位点之间存在着一个由7个Cas蛋白基因组成的蛋白群分别是cas6, DevR (cas7),cas5,cas3, cas4,cas1,cas2。根据对casl的比对以及Cas蛋白的排列,确定了中的CRISPR系统属于Ⅰ-B型并将其命名为CRISPR Ⅰ-SV14B系统。本研究以IBL14中svu016基因为靶基因,根据Ⅰ-B型CRISPR-Cas系统特点,选取TAC碱基序列作为打靶序列PAM位点。选取设计一段引导DNA以及同源臂整合到质粒pKC1139上,通过原生质体转化的方法将其转化到IBL14中进行打靶,实验结果表明svu016基因成功地被敲除掉。同时另一方面利用传统的敲除方式对svu016基因进行敲除,设计带有氯霉素抗性基因的同源臂整合到质粒pKC1139上转化到IBL14中,经过大量筛选结果仅获得一个敲除菌株。实验结果表明,利用CRISPR-Cas系统进行基因编辑的效率在70%以上,而传统方法编辑的效率仅为3%左右。同时说明Ⅰ-B型CRISPR-Cas系统可以被用来完成基因编辑,有被改造为基因编辑工具的潜能,同时编辑的效率以及准确性都比传统方法的要高。
【关键词】：CRJSPR-Cas系统 维吉尼亚链霉菌IBL14 基因编辑
【学位授予单位】：安徽大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78
【目录】：

• 摘要3-4
• ABSTRACT4-8
• 缩略词表8-9
• 第一章 概述9-19
• 1.1 链霉菌概述9
• 1.2 CRISPR概述9-17
• 1.2.1 CRISPR-Cas系统组织结构10-11
• 1.2.2 CRISPR-Cas系统分类11-12
• 1.2.3 CRISPR-Cas系统免疫机理12-15
• 1.2.4 CRISPR-Cas系统的应用15-17
• 1.3 CRISPR-Cas系统在链霉菌中的应用17
• 1.4 本课题研究目的、意义及主要内容17-19
• 第二章 维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统19-24
• 2.1 实验材料19
• 2.1.1 菌种信息19
• 2.1.2 实验中使用的本地软件及网络服务器19
• 2.2 实验方法19-20
• 2.2.1 基因组序列获得19
• 2.2.2 维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR位点预测与分析19-20
• 2.2.3 Cas蛋白的识别20
• 2.3 结果与讨论20-23
• 2.3.1 IBL14全基因组测序结果20
• 2.3.2 IBL14中的CRISPR位点20-21
• 2.3.3 IBL14中的cas基因21-23
• 2.4 本章小结23-24
• 第三章 利用IBL14中的CRISPR I-SV14B系统对基因进行编辑24-60
• 3.1 前言24
• 3.2 材料与方法24-46
• 3.2.1 菌株与质粒24-25
• 3.2.2 主要试剂,试剂盒和试剂配制25-28
• 3.2.3 主要仪器28-29
• 3.2.4 实验方法29-46
• 3.3 结果与分析46-57
• 3.3.1 利用CRISPR I-SV14B系统对svu016基因编辑结果46-54
• 3.3.2 传统方法对svu016基因编辑结果54-57
• 3.4 本章小结57-60
• 第四章 结论与展望60-62
• 4.1 结论60-61
• 4.2 展望61-62
• 参考文献62-67
• 附录67-77
• 致谢77-78
• 攻读学位期间发表的文章78

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1 雍德祥;维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统及其基因编辑方法[D];安徽大学;2016年

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本文编号：299119