利用CRISPR/Cas9系统建立Xist基因敲除猪模型

发布时间：2021-01-21 14:50

　　体细胞核移植技术在家畜良种繁育、基因修饰动物生产、濒危动物的拯救和人类疾病的治疗等领域具有重要的应用价值,但目前克隆动物生产效率较低,平均不超过5%。低下的克隆效率极大地限制了该技术的快速发展。在影响克隆猪生产效率的诸多因素中,X染色体的异常失活是导致克隆效率低下的重要原因,而与X染色体失活密切相关的一个重要基因是Xist基因,这表明Xist基因可能直接或间接地影响猪的克隆效率。本文以CRISPR/Cas系统为基础,在Xist基因上设计5个CRISPR/Cas系统打靶位点,并筛选出有效的Target 3、Target4 sg RNA,在细胞水平切割效率为1%和3%,在胚胎水平为75%和85.7%。同时将有效的sg RNA体外转录并显微注射至胚胎体内,发现Target 3和Target 4组合效果最好,敲除效率为100%。通过胞浆注射和胚胎移植方法生产出6头克隆猪,有2头活仔实现完全敲除。本文成功建立Xist基因敲除猪模型,为后续通过敲除猪Xist基因提高克隆效率的研究奠定了基础。 

【文章来源】：遗传. 2016,38(12)北大核心

【文章页数】：9 页

【部分图文】：

6-gRNA-N质粒测序结果

第12期李国等:用CRISPR/Cas9系统建立Xist基因猪模型1085图2T7E1内切酶检测各靶位点对应gRNA切割活性Fig.2Theindel(insertanddeletion)ofdifferentsgRNAsaftertreatedbyT7E1enzymeA～D分为Target2、Target3、Target4和Target5经T7E1内切酶酶切后的电泳结。1：突变体DNAPCR产物；2：野生型DNAPCR产物。M：500bpDNAMarker。图3Target3、Target4靶位点测序结果Fig.3Target3,Target4targetsitesequencingresultsA：靶点突变类。图中双下划线分为在Xist基因上设计的Target3、Target4靶点对应的序列；红色横线示碱基缺；红色示碱基揑。B：U6-gRNA-3和U6-gRNA-4转染8号单隆测序结；C：U6-gRNA-3和U6-gRNA-4转染11号单隆测序结。双下划线示在Xist基因上设计的Target3、Target4靶点对应sgRNA序列。

第12期李国等:用CRISPR/Cas9系统建立Xist基因猪模型1085图2T7E1内切酶检测各靶位点对应gRNA切割活性Fig.2Theindel(insertanddeletion)ofdifferentsgRNAsaftertreatedbyT7E1enzymeA～D分为Target2、Target3、Target4和Target5经T7E1内切酶酶切后的电泳结。1：突变体DNAPCR产物；2：野生型DNAPCR产物。M：500bpDNAMarker。图3Target3、Target4靶位点测序结果Fig.3Target3,Target4targetsitesequencingresultsA：靶点突变类。图中双下划线分为在Xist基因上设计的Target3、Target4靶点对应的序列；红色横线示碱基缺；红色示碱基揑。B：U6-gRNA-3和U6-gRNA-4转染8号单隆测序结；C：U6-gRNA-3和U6-gRNA-4转染11号单隆测序结。双下划线示在Xist基因上设计的Target3、Target4靶点对应sgRNA序列。

【参考文献】：
期刊论文
[1]CRISPR/Cas9的应用及脱靶效应研究进展[J]. 郑武,谷峰.  遗传. 2015(10)
[2]CRISPR/Cas系统:RNA靶向的基因组定向编辑新技术[J]. 李君,张毅,陈坤玲,单奇伟,王延鹏,梁振,高彩霞.  遗传. 2013(11)
[3]初次卵裂时间是猪克隆胚胎发育潜能的重要标识[J]. 罗学明,肖炜,冯冲,龙川,闫军,薛振华,云鹏,潘登科.  生物化学与生物物理进展. 2010(12)

博士论文
[1]小鼠2-细胞胚胎姐妹卵裂球基因差异表达研究[D]. 孙健红.西北农林科技大学 2012



本文编号：2991361