基于基因编辑技术的家蚕重要经济性状遗传改良研究

发布时间：2021-02-03 21:37

　　家蚕是重要的经济昆虫。家蚕品种的性状决定蚕丝的产量、品质及后续产品的附加值增幅。因此,培育优良品种一直是蚕业工作者努力的目标。培育家蚕优良品种的传统方法主要是通过突变筛选获得期待的性状,再通过遗传杂交的方式将目标性状导入到各个生产品种之中。但是,这种方法受到多种因素的限制而影响育种周期。近年来,随着基因组测序工作的推进以及基因编辑技术在家蚕上的应用,为定向育种和加快育种进度奠定了良好的基础。本研究旨在瞄准家蚕产量和质量性状这两项重要内容进行研究:第一,利用转基因和基因编辑技术对家蚕保幼激素（Juvenile hormone,JH）和蜕皮激素（20-hydroxyecdysone,20E）信号通路中的关键基因进行功能研究,阐明JH和20E调控家蚕个体发育的分子机制,构建高产量的家蚕品系;第二,整合转基因、基因定点敲除和敲入等多种遗传操作手段构建家蚕雌性特异胚胎致死系统,实现专养雄蚕,提高蚕丝质量。相关研究成果可为家蚕经济性状改良提供理论基础,具体研究内容和结果如下:1.家蚕保幼激素代谢通路中BmJHE基因的功能研究保幼激素酯酶（JH esterase,JHE）是昆虫JH代谢通路中最为关键... 

【文章来源】：华东师范大学上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：133 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
中文摘要
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第一章 绪论
    1.1 昆虫激素在调控体型大小方面发挥着中重要作用
    1.2 保幼激素控制昆虫体型大小的研究进展
        1.2.1 保幼激素的合成
        1.2.2 保幼激素的代谢
        1.2.3 保幼激素受体以及下游信号通路
        1.2.4 保幼激素调节体型大小的研究进展
    1.3 蜕皮激素控制昆虫体型大小的研究进展
        1.3.1 蜕皮激素的合成
        1.3.2 蜕皮激素的代谢
        1.3.3 蜕皮激素受体以及下游信号通路的研究进展
        1.3.4 蜕皮激素调控体型大小的研究进展
    1.4 营养信号通路控制昆虫体型大小的研究进展
    1.5 本研究的目的和意义
第二章 家蚕保幼激素代谢通路中BmJHE基因的功能研究
    2.1 引言
    2.2 材料与方法
        2.2.1 材料
        2.2.2 转基因质粒构建
        2.2.3 遗传转化和转基因阳性个体筛选
        2.2.4 RNA提取、纯化和cDNA合成
        2.2.5 实时荧光定量PCR
        2.2.6 基因组DNA提取
        2.2.7 突变分析
        2.2.8 反向PCR
        2.2.9 保幼激素酯酶活性检测
        2.2.10 转录组分析
        2.2.11 幼虫生长情况统计
        2.2.12 经济性状统计
        2.2.13 数据分析
    2.3 实验结果
        2.3.1 BmJHE-sgRNA转基因质粒的构建
        2.3.2 转基因品系构建和插入位点检测
        2.3.3 转基因CRISPR/Cas9介导BmJHE敲除和突变检测
        2.3.4 BmJHE基因突变影响保幼激素酯酶酶活性
        2.3.5 BmJHE基因突变延长家蚕幼虫生长周期
        2.3.6 转录组分析筛选BmJHE突变体中的差异表达基因
    2.4 讨论
    2.5 小结
第三章 家蚕蜕皮激素合成通路中BmTorso基因的功能研究
    3.1 引言
    3.2 材料与方法
        3.2.1 材料
        3.2.2 转基因质粒构建
        3.2.3 遗传转化和转基因阳性个体筛选
        3.2.4 RNA提取、纯化和cDNA合成
        3.2.5 实时荧光定量PCR
        3.2.6 基因组DNA提取
        3.2.7 突变分析
        3.2.8 蜕皮激素滴度测定
        3.2.9 蛋白提取
        3.2.10 免疫印记分析
        3.2.11 转录组分析
        3.2.12 幼虫生长情况统计
        3.2.13 经济性状统计
        3.2.14 数据分析
    3.3 实验结果
        3.3.1 BmTorso-sgRNA转基因质粒的构建
        3.3.2 转基因品系构建和插入位点检测
        3.3.3 转基因CRISPR/Cas9介导BmTorso敲除和突变检测
        3.3.4 BmTorso突变延长家蚕幼虫发育时间
        3.3.5 BmTorso基因突变对蜕皮激素滴度的影响
        3.3.6 BmTorso基因突变对蜕皮激素信号通路基因表达的影响
        3.3.7 转录组分析筛选BmTorso基因突变体中的差异表达基因
    3.4 讨论
    3.5 小结
第四章 家蚕雌性特异胚胎致死系统的构建研究
    4.1 引言
    4.2 材料与方法
        4.2.1 材料
        4.2.2 W染色体随机扩增多态性DNA标记Rikishi序列验证
        4.2.3 类转录激活因子核酸酶表达质粒和活性检测质粒构建
        4.2.4 类转录激活因子核酸酶切割活性检测
        4.2.5 体外转录mRNA
        4.2.6 配体质粒构建
        4.2.7 特异性表达Tra2-sgRNA转基因质粒构建
        4.2.8 类转录激活因子核酸酶介导的定点整合和阳性个体筛选
        4.2.9 Tra2-sgRNA转基因质粒的遗传转化和转基因阳性个体筛选
        4.2.10 反向PCR
        4.2.11 定点插入位点检测和靶基因突变分析
        4.2.12 RNA提取、纯化和cDNA合成
        4.2.13 逆转录PCR
    4.3 实验结果
        4.3.1 类转录激活因子核酸酶特异性靶点设计和配体质粒构建
        4.3.2 雌性特异性表达荧光家蚕品系的构建
        4.3.3 接头PCR验证W染色体特异性定点插入
        4.3.4 雌性特异性胚胎致死品系的构建
    4.4 讨论
    4.5 小结
第五章 总结与展望
    5.1 研究总结
    5.2 主要创新点
    5.3 不足与展望
参考文献
附录一 实验主要药品试剂
附录二 实验主要仪器
附录三 攻读博士学位期间发表的学术论文及参与的项目
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]家蚕限性育种研究进展[J]. 丁华静,喻蕾,魏国清,赵小明,刘朝良.  蚕桑茶叶通讯. 2012(04)
[2]多环境条件下家蚕主要经济性状杂种优势表现[J]. 何克荣,柳新菊,祝新荣,陈诗,夏建国,孟智启,俞碧华.  蚕桑通报. 2011(01)
[3]保幼激素合成的研究进展[J]. 刘艳,胜振涛,蒋容静,黄原,李胜.  昆虫学报. 2007(12)
[4]保幼激素的代谢[J]. 李胜,蒋容静,曹梅讯.  昆虫学报. 2004(03)



本文编号：3017186