基于硫化氢信号分子的群体感应型基因回路在大肠杆菌中的设计和构建研究
发布时间：2021-02-07 05:22
细菌的群体感应系统中,自诱导物通常并非常见的代谢中间产物,而是自身分泌的特定小分子物质。硫化氢（H2S）作为微生物产生的一种内源性小分子物质,具有自由跨膜的特性。大肠杆菌释放的H2S主要由3-巯基丙酮酸硫转移酶（3-MST）途径产生。以大肠杆菌为研究对象,我们发现作为第三类气体信号分子的H2S与菌体密度线性相关,而与大肠杆菌的种类、培养基类型以及培养基pH值无关。从动态调控工程的角度,H2S符合群体感应信号分子的特征,于是我们设计并构建了基于H2S信号分子的群体感应型基因回路。动态调控基因回路涉及几个关键元件:信号转换器-信号感受器-启动器。硫醌氧化还原酶（SQR）是定位于质膜内侧的一种硫氧化蛋白,其功能是氧化H2S生成硫烷硫（HSnH,n>2）,相比于H2S的自由穿膜,生成的HSnH会保存于胞内,因此SQR可以充当信号转换器的角色,将胞外H2S信号转换成胞内HSnH信号。由于大肠杆菌自身并不含有SQR,故将PpSQR和CpSQR分别在大肠杆菌中异源表达并检测其功能。结果显示二者都可以在大肠杆菌中正常发挥作用,但酶活具有差异显著。目前研究发现自然界存在多个能特异性感应硫烷硫的转录...
【文章来源】：山东大学山东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：80 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
符号说明
第一章 绪论
1.1 引言
2S简介"> 1.2 H2S简介
2S的理化性质及生理功能"> 1.2.1 H2S的理化性质及生理功能
2S的转运机制"> 1.2.2 H2S的转运机制
2S在生物体内的产生途径"> 1.2.3 H2S在生物体内的产生途径
2S的生物氧化"> 1.2.4 H2S的生物氧化
2S的检测"> 1.2.5 H2S的检测
1.3 硫烷硫简介
1.3.1 硫烷硫的理化性质及生理功能
1.3.2 硫烷硫的产生
1.3.3 硫烷硫的检测
1.4 硫氧化相关调控因子
1.4.1 BigR
1.4.2 CstR
1.4.3 SqrR
1.4.4 FisR
1.5 群体感应系统与动态代谢调控
1.5.1 群体感应
1.5.2 动态代谢调控
1.6 本论文的研究内容和意义
2S与菌体密度关系的研究">第二章 H2S与菌体密度关系的研究
2.1 实验材料
2.1.1 菌株和质粒
2.1.2 试剂和试剂盒
2.1.3 仪器设备
2.1.4 培养基和缓冲液
2.2 实验方法
2.2.1 生长曲线的测定
2.2.2 培养基pH的恒定
2S"> 2.2.3 HPLC法检测H2S
2.2.4 SSP4法检测胞内多硫化物
2.3 结果与讨论
2S释放量与大肠杆菌菌体密度线性相关"> 2.3.1 H2S释放量与大肠杆菌菌体密度线性相关
2S菌体密度相关性的影响"> 2.3.2 不同遗传背景的菌株对H2S菌体密度相关性的影响
2S菌体密度相关性的影响"> 2.3.3 不同培养基对H2S菌体密度相关性的影响
2S菌体密度相关性的影响"> 2.3.4 pH值对H2S菌体密度相关性的影响
2.4 本章小结
第三章 群体感应型基因回路的构建
3.1 实验材料
3.1.1 菌株和质粒
3.1.2 本章所用引物
3.1.3 试剂和试剂盒
3.1.4 仪器设备
3.1.5 培养基和缓冲液
3.2 实验方法
3.2.1 E.coli TSB法感受态的制备（KCM法）
3.2.2 E.coli电转感受态的制备
3.2.3 E.coli热击感受态的制备（化学感受态）
3.2.4 多硫化物的制备及浓度检测
3.2.5 荧光报告系统的构建
3.2.6 多硫化物的外源添加诱导
2O2的外源添加诱导"> 3.2.7 H2O2的外源添加诱导
3.2.8 生长周期及荧光值的酶标仪检测
3.3 结果与分析
3.3.1 信号转换器的筛选
3.3.2 信号感受器的筛选
3.3.3 信号感受器与启动器的组装
3.3.4 完整基因回路的组装与测试
3.3.5 完整基因回路具有同步性和稳定性
3.3.6 遗传背景、转换器效率等因素对基因回路的影响
3.4 本章小结
第四章 群体感应型基因回路的应用研究
4.1 实验材料
4.1.1 菌株和质粒
4.1.2 本章所用引物
4.1.3 试剂和缓冲液
4.1.4 仪器设备
4.2 实验方法
4.2.1 HPLC法测木糖及木糖酸含量
4.2.2 流式细胞仪检测荧光蛋白表达量
4.2.3 微流控细胞培养及检测
4.2.4 BL21（CstR-DE3）重组菌株的构建
4.2.5 细胞全蛋白的SDS-PAGE检测
4.3 结果与分析
4.3.1 木糖酸生产的动态调控
4.3.2 群体感应型基因回路用于蛋白表达纯化
4.3.3 BL21 （CstR-DE3）菌株的改造
4.3.4 构建并测试适配新菌株的质粒表达载体
4.4 本章小结
第五章 全文总结与展望
参考文献
致谢
发表论文
学位论文评阅及答辩情况表
本文编号：3021727
【文章来源】：山东大学山东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：80 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
符号说明
第一章 绪论
1.1 引言
2S简介"> 1.2 H2S简介
2S的理化性质及生理功能"> 1.2.1 H2S的理化性质及生理功能
2S的转运机制"> 1.2.2 H2S的转运机制
2S在生物体内的产生途径"> 1.2.3 H2S在生物体内的产生途径
2S的生物氧化"> 1.2.4 H2S的生物氧化
2S的检测"> 1.2.5 H2S的检测
1.3 硫烷硫简介
1.3.1 硫烷硫的理化性质及生理功能
1.3.2 硫烷硫的产生
1.3.3 硫烷硫的检测
1.4 硫氧化相关调控因子
1.4.1 BigR
1.4.2 CstR
1.4.3 SqrR
1.4.4 FisR
1.5 群体感应系统与动态代谢调控
1.5.1 群体感应
1.5.2 动态代谢调控
1.6 本论文的研究内容和意义
2S与菌体密度关系的研究">第二章 H2S与菌体密度关系的研究
2.1 实验材料
2.1.1 菌株和质粒
2.1.2 试剂和试剂盒
2.1.3 仪器设备
2.1.4 培养基和缓冲液
2.2 实验方法
2.2.1 生长曲线的测定
2.2.2 培养基pH的恒定
2S"> 2.2.3 HPLC法检测H2S
2.2.4 SSP4法检测胞内多硫化物
2.3 结果与讨论
2S释放量与大肠杆菌菌体密度线性相关"> 2.3.1 H2S释放量与大肠杆菌菌体密度线性相关
2S菌体密度相关性的影响"> 2.3.2 不同遗传背景的菌株对H2S菌体密度相关性的影响
2S菌体密度相关性的影响"> 2.3.3 不同培养基对H2S菌体密度相关性的影响
2S菌体密度相关性的影响"> 2.3.4 pH值对H2S菌体密度相关性的影响
2.4 本章小结
第三章 群体感应型基因回路的构建
3.1 实验材料
3.1.1 菌株和质粒
3.1.2 本章所用引物
3.1.3 试剂和试剂盒
3.1.4 仪器设备
3.1.5 培养基和缓冲液
3.2 实验方法
3.2.1 E.coli TSB法感受态的制备（KCM法）
3.2.2 E.coli电转感受态的制备
3.2.3 E.coli热击感受态的制备（化学感受态）
3.2.4 多硫化物的制备及浓度检测
3.2.5 荧光报告系统的构建
3.2.6 多硫化物的外源添加诱导
2O2的外源添加诱导"> 3.2.7 H2O2的外源添加诱导
3.2.8 生长周期及荧光值的酶标仪检测
3.3 结果与分析
3.3.1 信号转换器的筛选
3.3.2 信号感受器的筛选
3.3.3 信号感受器与启动器的组装
3.3.4 完整基因回路的组装与测试
3.3.5 完整基因回路具有同步性和稳定性
3.3.6 遗传背景、转换器效率等因素对基因回路的影响
3.4 本章小结
第四章 群体感应型基因回路的应用研究
4.1 实验材料
4.1.1 菌株和质粒
4.1.2 本章所用引物
4.1.3 试剂和缓冲液
4.1.4 仪器设备
4.2 实验方法
4.2.1 HPLC法测木糖及木糖酸含量
4.2.2 流式细胞仪检测荧光蛋白表达量
4.2.3 微流控细胞培养及检测
4.2.4 BL21（CstR-DE3）重组菌株的构建
4.2.5 细胞全蛋白的SDS-PAGE检测
4.3 结果与分析
4.3.1 木糖酸生产的动态调控
4.3.2 群体感应型基因回路用于蛋白表达纯化
4.3.3 BL21 （CstR-DE3）菌株的改造
4.3.4 构建并测试适配新菌株的质粒表达载体
4.4 本章小结
第五章 全文总结与展望
参考文献
致谢
发表论文
学位论文评阅及答辩情况表
本文编号：3021727
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/jiyingongcheng/3021727.html
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