华细辛肉桂醇脱氢酶基因CAD的克

发布时间：2021-02-07 18:09

　　肉桂醇脱氢酶（Cinnamyl alcohol dehydrogenase,CAD）催化松柏醛生成松柏醇,是华细辛主要药理活性成分甲基丁香酚生物合成途径中的关键酶之一。分离CAD基因并进行功能验证是调控华细辛甲基丁香酚生物合成的基础工作。本研究通过转录组测序数据库筛选到华细辛7个可能的CAD基因转录本（AsGAD1～7）,同时通过同源克隆获得1个华细辛CAD基因（AsCAD）;对上述8个基因进行了生物信息学分析并构建了系统发育树,初步预测了华细辛CAD基因家族成员的特征;利用实时荧光定量PCR筛选出华细辛在不同生长时期及不同组织中进行基因表达定量分析时适宜的内参基因18SrRNA,在此基础上,进行AsCADs差异表达分析;利用Gateway技术构建AsCAD基因过表达载体pK7FWG2.0-AsGAD,通过浸花法转化拟南芥,检测木质素含量,验证基因功能。主要研究结果如下:（1）基于转录组测序数据库筛选出7个可能的华细辛GAD家族成员,分别命名为AsCAD1～7,向NCBI提交后,在GenBank中的登陆号分别为KY446440～KY446446。利用生物信息学相关分析软件对AsCADs... 

【文章来源】：华东师范大学上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：103 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 综述
    1.1 华细辛种质资源研究概况
        1.1.1 细辛属植物系统分类概况
        1.1.2 华细辛生长发育特征与资源现状
    1.2 中药细辛研究进展
        1.2.1 细辛药理活性成分与应用价值
        1.2.2 细辛毒性与安全用药
    1.3 甲基丁香酚研究进展
        1.3.1 甲基丁香酚生物合成途径
        1.3.2 甲基丁香酚应用价值
    1.4 CAD研究概况
        1.4.1 CAD蛋白结构特征与酶学特性
        1.4.2 CAD在植物生长发育中作用
        1.4.3 CAD家族成员的分类
        1.4.4 CAD基因差异表达分析
        1.4.5 CAD基因克隆与功能验证
    1.5 立题背景与意义
第二章 基于转录组测序数据库华细辛CAD基因的挖掘
    2.1 引言
    2.2 实验材料
    2.3 实验方法
        2.3.1 华细辛CAD基因的挖掘
        2.3.2 华细辛CAD结构与功能预测
        2.3.3 华细辛CAD系统发育分析
    2.4 实验结果与讨论
        2.4.1 华细辛CAD基因的挖掘
        2.4.2 华细辛CAD结构与功能预测
        2.4.3 华细辛CAD系统进化分析
    2.5 本章小结
第三章 华细辛CAD基因的同源克隆与分析
    3.1 引言
    3.2 实验器材
        3.2.1 实验材料
        3.2.2 实验试剂
        3.2.3 实验仪器
    3.3 实验方法
        3.3.1 华细辛叶片总RNA提取
        3.3.2 华细辛cDNA合成
        3.3.3 华细辛CAD基因保守片段克隆
        3.3.4 华细辛CAD基因5'RACE与3'RACE扩增
        3.3.5 华细辛CAD基因cDNA全长的获得
        3.3.6 华细辛CAD基因生物信息学分析
        3.3.7 CAD系统发育分析
    3.4 实验结果与讨论
        3.4.1 华细辛叶片总RNA提取
        3.4.2 华细辛CAD基因克隆引物设计
        3.4.3 华细辛CAD基因保守片段的克隆以及5'/3'RACE扩增
        3.4.4 华细辛CAD基因cDNA全长的获得
        3.4.5 华细辛CAD基因生物信息学分析
        3.4.6 CAD系统发育分析
    3.5 本章小结
第四章 华细辛实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛选
    4.1 引言
    4.2 实验器材
        4.2.1 实验材料
        4.2.2 实验试剂
        4.2.3 实验仪器
    4.3 实验方法
        4.3.1 华细辛不同生长时期不同组织总RNA提取
        4.3.2 华细辛cDNA合成
        4.3.3 候选内参基因选择与引物设计
        4.3.4 实时荧光定量PCR反应体系与程序设定
        4.3.5 实时荧光定量PCR内参筛选相关软件
    4.4 实验结果与讨论
        4.4.1 华细辛不同生长时期不同组织总RNA提取
        4.4.2 实时荧光定量PCR内参筛选相关软件分析结果
    4.5 本章小结
第五章 华细辛CAD基因差异表达分析
    5.1 引言
    5.2 实验器材
    5.3 实验方法
        5.3.1 华细辛总RNA提取与cDNA合成
        5.3.2 AsCADs荧光定量PCR引物设计与程序设定
        5.3.3 AsCADs表达分析
    5.4 实验结果与讨论
        5.4.1 华细辛不同生长时期不同组织总RNA提取
        5.4.2 AsCADs荧光定量PCR引物设计
        5.4.3 AsCADs荧光定量PCR引物特异性分析
        5.4.4 AsCADs表达分析
    5.5 本章小结
第六章 AsCAD基因转拟南芥真核表达分析
    6.1 引言
    6.2 实验器材
        6.2.1 实验材料
        6.2.2 菌株与载体
        6.2.3 主要培养基
        6.2.4 主要试剂与仪器
    6.3 实验方法
        6.3.1 表达载体构建
        6.3.2 重组质粒转入根瘤农杆菌GV3101
        6.3.3 农杆菌介导稳定转化拟南芥
        6.3.4 拟南芥转基因阳性植株筛选
        6.3.5 转基因拟南芥木质素含量测定
    6.4 结果与讨论
        6.4.1 表达载体构建
        6.4.2 转基因拟南芥阳性植株的获得
        6.4.3 转基因拟南芥PCR验证结果
        6.4.4 转基因拟南芥木质素含量测定结果
    6.5 本章小结
第七章 研究总结与展望
    7.1 研究总结
    7.2 工作展望
参考文献
附录Ⅰ
附录Ⅱ
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]细辛挥发油成分提取与甲基丁香酚含量测定的研究进展[J]. 潘磊,郑柳,牛卉,赵晓冰,柳威,刘忠.  时珍国医国药. 2015(04)
[2]甲基丁香酚对桔小实蝇的诱集日动态及其缓释方法[J]. 薛超,许益镌,曾玲.  环境昆虫学报. 2015(01)
[3]药用植物功能基因的研究思路与展望——以甘草为例[J]. 刘春生,刘颖.  中国实验方剂学杂志. 2015(01)
[4]木质素生物合成中肉桂醇脱氢酶基因（CAD）的研究进展[J]. 曹佳强,李波,杨洋,胡文冉,王玉晶,范玲.  分子植物育种. 2014(05)
[5]马尾松CAD基因的克隆及其编码蛋白质的结构预测[J]. 张逢凯,潘婷,盛璐,季孔庶.  分子植物育种. 2014(04)
[6]参与农杆菌侵染及T-DNA转运过程植物蛋白的研究进展和思考[J]. 赵佩,王轲,张伟,杜丽璞,叶兴国.  中国农业科学. 2014(13)
[7]中草药细辛研究进展[J]. 王晓丽,金礼吉,续繁星,徐永平,李晓宇.  亚太传统医药. 2013(07)
[8]超声辅助提取华细辛挥发油中甲基丁香酚工艺优化[J]. 欧阳天贽,袁泉.  天然产物研究与开发. 2013(02)
[9]细辛煎煮过程中甲基丁香酚、黄樟醚和细辛脂素的变化研究[J]. 黄鲛,易进海,刘玉红,黄志芳,陈燕,刘云华.  中成药. 2012(10)
[10]生物信息学研究现状及发展趋势[J]. 赵屹,谷瑞升,杜生明.  医学信息学杂志. 2012(05)

博士论文
[1]拟南芥4CL3基因在类黄酮合成代谢中的功能分析[D]. 林建中.湖南大学 2009

硕士论文
[1]蜡梅肉桂醇脱氢酶基因CpCAD的克隆、表达特性分析及功能验证[D]. 李志菜.西南大学 2013



本文编号：3022614