奇异变形杆菌醇脱氢酶的克隆表达及酶学性质研究

发布时间：2021-02-13 22:41

　　醇脱氢酶（ADHs,EC 1.1.1.1）,是属于氧化还原酶的第一亚类,该酶通常可以使用NAD（P）H作为辅酶将醛或酮转化为相对应的醇。醇脱氢酶由于其各种独特的生理生化性质和酶学性质,因而被广泛的应用于各个方面,主要是医学研究、化工生产、食品研究以及生物工程研究。在本论文中,在大肠杆菌中成功地表达了5个来源于奇异变形杆菌Proteus mirabilis JN458中的醇脱氢酶,优化了表达质粒和诱导条件,并探究了五种醇脱氢酶的酶学性质,为研究奶酪芳香气味的产生奠定了分子生物学基础。主要研究结果如下:（1）成功克隆了5个来源于P.mirabilis JN458的醇脱氢酶基因（adh1、adh2、adh3、adh4、adh5）,将5个基因成功与pColdⅡ质粒相连,构建重组质粒后,将其转入Escherichia coli BL21（DE3）中并对其进行表达。预测得到的5个醇脱氢酶的蛋白分子量分别为40.1kDa、41.3 kDa、42.4 kDa、39.3 kDa和37.3 kDa。酶活验证发现5个醇脱氢酶对苯乙醛均具有一定的酶活。（2）由于pColdⅡ质粒的蛋白表达量和酶活不高,因此对表... 

【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：50 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
    1.1 醇脱氢酶
        1.1.1 醇脱氢酶的简介
        1.1.2 醇脱氢酶的来源
        1.1.3 醇脱氢酶的分类
        1.1.4 醇脱氢酶的结构
        1.1.5 醇脱氢酶的催化历程
        1.1.6 醇脱氢酶的性质
        1.1.7 醇脱氢酶的应用
        1.1.8 醇脱氢酶的研究进展
    1.2 论文的立题依据和意义
    1.3 论文的研究内容
第二章 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 菌种与质粒
        2.1.2 主要实验仪器
        2.1.3 酶与实验药品
        2.1.4 培养基
    2.2 实验方法
        2.2.1 P.mirabilis JN458基因组的提取
        2.2.2 E.coli感受态细胞的制备和转化
        2.2.3 琼脂糖凝胶电泳
        2.2.4 ADHs基因的克隆和重组菌株的构建
        2.2.5 重组大肠杆菌的诱导表达
        2.2.6 表达质粒的选择
        2.2.7 重组大肠杆菌的生长曲线
        2.2.8 重组大肠杆菌诱导条件的优化
        2.2.9 蛋白电泳
        2.2.10 蛋白浓度测定
        2.2.11 ADHs的分离纯化
        2.2.12 ADHs的酶活测定
        2.2.13 苯乙醇的高效液相色谱检测
        2.2.14 ADHs酶学性质研究
第三章 结果与讨论
    3.1 ADHs的预测及克隆表达验证
        3.1.1 ADHs的预测
        3.1.2 ADHs的基因克隆
        3.1.3 ADHs的表达验证
        3.1.4 ADHs的序列分析
    3.2 质粒的选择
        3.2.1 质粒的选择
        3.2.2 不同重组质粒酶活验证
    3.3 诱导条件的优化
        3.3.1 培养基的初始pH的优化
        3.3.2 诱导初始细胞浓度的优化
        3.3.3 诱导剂浓度的优化
        3.3.4 诱导温度的优化
        3.3.5 诱导后的培养时间的优化
        3.3.6 摇瓶溶氧的优化
    3.4 ADHs的分离纯化
    3.5 ADHs的酶学性质
        3.5.1 ADHs的最适反应pH和 pH稳定性
        3.5.2 ADHs的最适反应温度和温度稳定性
        3.5.3 ADHs的底物特异性
        3.5.4 金属离子、EDTA对酶活性的影响
        3.5.5 ADHs的动力学参数
主要结论与展望
    主要结论
    展望
致谢
参考文献
附录1：作者在攻读硕士学位期间的科研成果
附录2：苯乙醇标准曲线测定图


【参考文献】：
期刊论文
[1]醇脱氢酶的纯化、酶学性质及其不对称催化[J]. 程书兰,魏淼,许琳,严明.  生物加工过程. 2016(01)
[2]醋化醋杆菌产乙醇脱氢酶发酵培养基的优化[J]. 王陶,李文,陈亚庆.  粮油食品科技. 2014(01)
[3]乙醇脱氢酶基因和乙醛脱氢酶基因的克隆及表达[J]. 汤斌,杨亚平,张莹莹.  工业微生物. 2013 (03)
[4]荧光假单胞菌短链脱氢酶的克隆、表达及酶学性质分析[J]. 薛群,应向贤,杨池,汪钊.  生物工程学报. 2011(09)
[5]氧化葡萄糖酸杆菌DSM 2003膜结合乙醇脱氢酶的纯化鉴定和性质研究[J]. 韦柳静,林金萍,杨雪鹏,魏东芝.  食品科学. 2010(13)
[6]脂肪肝发病机制研究进展[J]. 刘军,潘珩.  临床和实验医学杂志. 2006(04)
[7]柴胡黄芩配伍抗大鼠急性酒精性肝损伤作用的实验研究[J]. 刘仁慧,王宪龄,刘方洲,李佺,黄琦.  时珍国医国药. 2006(02)
[8]ALG-SiO2杂化凝胶固定化多酶体系催化CO2转化甲醇研究[J]. 许松伟,陆杨,苑伟康,吴洪,姜忠义.  生物加工过程. 2005(03)
[9]乙醇代谢对冬枣果实外观品质的影响[J]. 申琳,生吉萍.  保鲜与加工. 2005(04)
[10]连续监测法测定乙醇脱氢酶及其对肝脏疾病的诊断意义[J]. 孙阳,吕健宏,陈环.  国外医学(临床生物化学与检验学分册). 2005(06)

硕士论文
[1]酿酒酵母乙醇脱氢酶2和乙醛脱氢酶以及两种水生动物抗菌肽的表达和酶活分析[D]. 舒梅.南昌大学 2011
[2]人乙醇脱氢酶ADH1B2的基因表达和活性分析[D]. 汤甜甜.浙江大学 2011
[3]乙醇脱氢酶的克隆表达及生物活性分析[D]. 鲍文娜.浙江大学 2007



本文编号：3032685