藏红花类胡萝卜素基因的原核表达

发布时间：2021-02-14 07:27

　　藏红花（Crocus sativus L.）作为一种名贵的中药材,以柱头所含丰富且特殊的类胡萝卜素物质被称为“植物黄金”。藏红花仅以柱头入药,人们始终希望通过各种方式解决其应用的资源瓶颈问题。已经阐明藏红花类胡萝卜素合成途径和相关基因,在此基础上本论文通过克隆藏红花柱头中类胡萝卜素合成的几个关键酶基因、并构建大肠杆菌的表达体系研究藏红花类胡萝卜素的合成问题。经反转录和聚合酶链式反应的方法获得了藏红花柱头表达的CsZCD（玉米黄素裂解酶基因）、CsCCD2（类胡萝卜素裂解双加氧酶2基因）以及醛脱氢酶（CsALDH）基因家族的CsALDH2、CsALDH3、CsALDH5、CsALDH6类胡萝卜素合成相关基因。采用同源重组的方法构建得到pET28a-Crt-ZCD和pET28a-Crt-CCD2玉米黄素合成载体以及pTRI-P-ALDH2、pTRI-P-ALDH3、pTRI-P-ALDH5、pTRI-P-ALDH6诱导型和组成型共12个表达型载体。在此基础上将质粒pET28a-Crt-ZCD或pET28a-Crt-CCD2单独以及分别与载体pTRI-P-ALDH2、pTRI-P-ALDH3... 

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藏红花中主要类胡萝卜素及结构式（BukhariSetal.,2018Biomedicine&Pharmacotherapy）

上海师范大学硕士学位论文第一章引言5种裂解双加氧酶，负责裂解步骤，导向从前体玉米黄质开始的藏红花酸生物合成。CCD2和ZCD的功能在藏红花合成途径中是相同的。图1-2玉米黄素合成藏红花素过程(Frusciante,S.,etal.,2014)由于拟南芥在分子克隆和基因编辑上的优势以及强大的基因组和蛋白质组学工具，使得拟南芥中的类胡萝卜素合成也被探究[38]。早在2006年，Schmidt,HolgerHolger.SchmidtMytum.等人就通过气相和液相色谱-质谱以及核磁共振分析等方法证明了AtCCD1这种类胡萝卜素裂解酶在拟南芥中的裂解机制[39]。藏红花素合成的一些关键酶基因也在拟南芥中存在。例如PSY基因，通过一些生物技术方法，如组织特异性PSY过度表达，成功地增加了与农业相关的非绿色植物组织中的类胡萝卜素含量[40]。如图1-3所示[41]在拟南芥中类胡萝卜素主要是由MEP途径产生的IPP和DMAPP合成的，向DMAPP中添加三个IPP分子可生成GGPP，它是包括类胡萝卜素在内的几种质体类异戊二烯的前体，类胡萝卜素生物合成的第一步是通过两个GGPP分子的缩合产生40个碳的八氢番茄红素，这种由八氢番茄红素合成酶（PSY）催化的反应被认为是类胡萝卜素途径中的关键性因素，八氢番茄红素经过去饱和和异构化产生番茄红素。番茄红素末端的环化形成-胡萝卜素或者-胡萝卜素，这也是这条合成途径的第一个分支点。胡萝卜素经过羟基化分别形成叶黄素和玉米黄素，这些类胡萝卜素经过进一步的修饰在拟南芥及其他植物中产生多种类胡萝卜素。另外类胡萝卜素作为重要激素的前体可以进入多种途径，如

第一章引言上海师范大学硕士学位论文101.5细菌中类胡萝卜素合成研究目前藏红花类胡萝卜素的合成途径已经被部分阐明，并且随着合成生物学的发展，在微生物中导入异源目的基因合成酶或其他发酵产物的研究已经较为成熟。所以通过微生物发酵合成藏红花类胡萝卜素也成为传统方法之外的最有前景的研究方法。光合细菌是一种可进行原始光能合成的原核生物，现已知的可以利用光合细菌进行合成的类胡萝卜素有80多种[56]。红假单胞菌和红杆菌常用来研究，可以通过优化培养基来提高类胡萝卜素的产量。Marasco,ErinK研究了五个不同的蓝细菌中的类胡萝卜素裂解双加氧酶（CCD）同源基因在大肠杆菌中的裂解活性，在一种蓝细菌中鉴定出的类胡萝卜素裂解活性的多样性表明，CCD不仅促进光合色素的降解，而且还产生载脂体素[57]。大肠杆菌具有清晰的遗传背景，在简单的培养条件下生长速度快，并且有许多成熟的大规模发酵技术。因此，它受到代谢工程研究人员的强烈支持，目前更多研究人员利用大肠杆菌这种工程菌来研究类胡萝卜素的合成。研究人员根据光合细菌荚膜红杆菌的类胡萝卜素生物合成基因，构建了含有六个开放阅读框的质粒pCAR25，分别是crtE、crtX、crtY、crtI、crtB和crtZ基因；只有crtZ与其他基因的方向相反，其中crtE是植物中PSY基因的同源基因，crtZ是β-胡萝卜素羟化酶，合成途径见图1-4。通过对表达这6个基因的大肠杆菌转化子中积累的类胡萝卜素的分析，阐明了MEP的类胡萝卜素生物合成途径[58]。并通过薄层层析等手段鉴定大肠杆菌的产物，得到了类胡萝卜素。图1-4光合细菌中类胡萝卜素的合成途径及产物

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博士论文
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硕士论文
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本文编号：3033342