CRISPR/Cas9系统在斑马鱼基因编辑研究中的应用

发布时间：2021-02-16 03:49

　　随着斑马鱼（Danio rerio）基因组测序工作的完成,研究人员发现斑马鱼与人类（Homo sapiens）基因同源性较高,针对这一特点,研究人员构建了多种人类疾病的斑马鱼模型,用于探究疾病发生机制。基因编辑技术的应用促进了斑马鱼基因功能研究的发展,先进的基因编辑技术CRISPR/Cas9系统,因其简单高效正广泛被应用。本研究利用CRISPR/Cas9系统敲除斑马鱼lncRNA基因启动子区以及将dCas9基因敲入斑马鱼基因组。本文主要的研究内容如下：1、为了研究Nondret002679在斑马鱼胚胎各时期以及成年后各组织中的表达规律,首先收集0 hpf（合子期）、3 hpf（囊胚期）、6 hpf（原肠期）、12hpf（体节期/5-体节）、24hpf（咽囊期）及48hpf（孵化期）的斑马鱼胚胎提取总RNA,逆转录为cDNA,采用荧光定量PCR （RT-qPCR）方法检测Nondmt002679的表达规律。同时收集成年斑马鱼的心脏、肝脏、睾丸、卵巢、肌肉、尾鳍7组织样,同样采用RT-qPCR方法检测Nondret002679的表达规律。结果显示,24 h时Nondret002679表达量... 

【文章来源】：扬州大学江苏省

【文章页数】：68 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
中文摘要
Abstract
符号说明
引言
文献综述
    1 斑马鱼研究进展
        1.1 模式生物斑马鱼简介
        1.2 斑马鱼研究历史
        1.3 斑马鱼在人类疾病研究中的应用
    2 CRISPR/Cas9系统研究进展
        2.1 CRISPR/Cas9系统简介
            2.1.1 CRISPR/Cas系统研究历史
            2.1.2 CRISPR/Cas9系统简介
        2.2 CRISPR/Cas9系统介导的基因敲除
        2.3 CRISPR/Cas9系统介导的基因敲入
        2.4 CRISPR/Cas9系统介导的基因调控
        2.5 CRISPR/Cas9系统与其它基因编辑技术的比较
    3 本研究的立题依据及研究意义
        3.1 初步探究Nondret002679表达规律及其启动子区敲除
        3.2 dCas9斑马鱼模型的构建
    4 研究展望
第一章 探究Nondret002679在斑马鱼胚胎各阶段及各组织的表达规律
    前言
    1 材料与方法
        1.1 试验试剂
        1.2 实验仪器
        1.3 试验动物
        1.4 斑马鱼胚胎的各阶段以及各组织中Nondret002679表达量的差异分析
            1.4.0 各阶段斑马鱼胚胎的收集
            1.4.1 成年斑马鱼的解剖
            1.4.2 采用TRIzoL试剂提取胚胎中的总RNA
            1.4.3 RNA浓度的检测
            1.4.4 逆转录合成cDNA
            1.4.5 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测
            1.4.6 统计学处理
    2 结果与分析
        2.1 Nondret002679在斑马鱼胚胎各阶段表达量的差异分析
        2.2 Nondret002679在斑马鱼的各组织中表达量的差异分析
    3 讨论
第二章 CRISPR/Cas9系统介导的Nondret002679启动子区敲除
    前言
    1 材料与方法
        1.1 实验仪器
        1.2 试验试剂
        1.3 Nondret002679靶位点的选择
        1.4 gRNA体外转录模板的合成及转录
            1.4.1 gRNA体外转录模板的合成
            1.4.2 gRNA的体外转录
        1.5 Cas9 mRNA体外转录
        1.6 显微注射及敲除鉴定
            1.6.1 显微注射
            1.6.2 斑马鱼DNA的提取
            1.6.3 Nondret002679启动子区敲除鉴定
        1.7 启动子区缺失的斑马鱼的纯合鉴定
        1.8 启动子区敲除的杂合斑马鱼Nondret002679的表达分析
    2 结果
        2.1 早期斑马鱼敲除鉴定结果
        2.2 2月龄斑马鱼敲除鉴定结果
        2.3 启动子区缺失的纯合斑马鱼的获得
        2.4 启动子区敲除的杂合斑马鱼Nondret002679的表达分析结果
    3 讨论
第三章 CRISPR/Cas9系统介导的dCas9定点敲入斑马鱼基因组模型的构建
    前言
    1 材料与方法
        1.1 材料
        1.2 仪器设备
        1.3 dCas9 donor载体构建引物的设计与合成
        1.4 dCas9 donor载体的构建
        1.5 靶位点的选择
        1.6 显微注射及敲入鉴定
        1.7 杂合斑马鱼的dCas9的表达分析
    2 结果与分析
        2.1 dCas9敲入斑马鱼基因组的鉴定结果
        2.2 纯合dCas9斑马鱼鉴定结果
        2.3 杂合斑马鱼的dCas9表达分析结果
    3 讨论
全文结论
参考文献
致谢
攻读学位期间发表学术论文


【参考文献】：
期刊论文
[1]CRISPR/Cas技术研究进展[J]. 常振仪,严维,刘东风,陈竹锋,谢刚,卢嘉威,吴建新,唐晓艳.  农业生物技术学报. 2015(09)
[2]Development of Novel Visual-Plus Quantitative Analysis Systems for Studying DNA Double-Strand Break Repairs in Zebrafish[J]. Jingang Liu(a,1),Lu Gong(a,1),Changqing Chang(b,1,2),Cong Liuc,Jinrong Peng(b,),Jun Chen(a,) a College of Life Sciences,Zhejiang University,866 Yu Hang Tang Road,Hangzhou 310058,China b College of Animal Sciences,Zhejiang University,866 Yu Hang Tang Road,Hangzhou 310058,China c Developmental and Stem Cell Institute,West China Second University Hospital,Sichuan University,Chengdu 610041,China 2 Present address:College of Natural Resources and Environment,South China Agricultural University,Guangzhou 510650,China..  遗传学报. 2012(09)
[3]斑马鱼与人类疾病模型的研究[J]. 徐振华,赵慕钧,李载平.  生命的化学. 2002(04)



本文编号：3036101