BRD4短亚型蛋白质液-液相分离激活基因转录机制的体外研究
发布时间：2021-02-20 16:54
BRD4蛋白是BET蛋白家族最重要的成员,在调控基因转录、DNA复制与修复、细胞周期等过程中发挥关键作用,与多种癌症的发生发展密切相关,包括急性髓系白血病、多发性骨髓瘤、伯基特淋巴瘤、NUT中线癌、结肠癌和乳腺癌等。作为转录调控因子的一员,BRD4也对保持染色质高度有序的结构具有重要作用,介导多种转录相关因子在基因增强子上的招募,从而促进转录激活。由于m RNA成熟过程中的可变剪接,BRD4蛋白存在两个亚型,长亚型（BRD4L）和短亚型（BRD4S）。BRD4S（氨基酸1-722）包含了BRD4L的N端区域的719个氨基酸,和C端的三个与BRD4L不同的氨基酸,GPA。目前,对于BRD4L长亚型蛋白的研究较多,而对于BRD4短亚型的功能还知之甚少。液-液相分离（LLPS）是指两种液体不溶于一种均一液相中,产生了不同的相-相分离的现象。当溶液中的生物大分子例如蛋白质或者核酸经历液-液相分离时,它们会聚集在一个密集的类似液滴相中,与此同时也形成一个稀疏的相。越来越多的研究表明,液-液相分离是细胞内形成无膜隔间的机制。液-液相分离在生物体内普遍存在,在染色质结构、基因转录调控、翻译、表观遗传...
【文章来源】：吉林大学吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：82 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
液-液相分离受多种因素影响[42]
研究报道,BRD4L蛋白质长亚型的C-末端能够与介导蛋白Med1在超级增强子区域形成液-液相分离[89],为了研究BRD4S或者BRD4L的N末端氨基酸序列是否具有形成液-液相分离的能力,我们在体外表达纯化了BRD4S(1-719),并且用荧光标签Alexa-Fluor 488进行标记。荧光共聚焦显微镜下观察到,在体外低盐条件下(65 mM NaCl,2%PEG-6000),BRD4S(1-719)在0.5μM蛋白质浓度形成液-液相分离的液滴(图3.1A)。并且,随着BRD4S(1-719)蛋白质浓度的增加,其形成的相分离的液滴的数量及总面积均相应增加,这说明BRD4S(1-719)在体外条件下形成的液-液相分离具有浓度依赖性(图3.1B)。为了确定BRD4短亚型蛋白质形成液滴的关键氨基酸序列,我们表达纯化了含EGFP荧光标签的两段BRD4S截短型蛋白质EGFP-BD2-CPS(347-720)和EGFP-BD1-BD2(44-477)(图3.2A)。结果显示,EGFP-BD2-CPS和EGFP-BD1-BD2蛋白质在室温及低盐条件下均可形成球状的液-液相分离的液滴,而EGFP-BD1-BD2的相分离液滴与EGFP-BD2-CPS的液滴相比数量较少,体积较小(图3.2B)。EGFP-BD2-CPS和EGFP-BD1-BD2蛋白质的液滴在加入2%的PEG-6000前后未见明显变化,说明BRD4S蛋白质片段无需PEG-6000就能够形成液相分离;游离的EGFP标签蛋白质分子分别在有无PEG-6000条件下均呈澄清状态(图3.2C),未见EGFP标签蛋白质对BRD4S蛋白质的液滴形成的影响。为了进一步证明BRD4S蛋白质形成的液-液相分离并非由EGFP导致,我们纯化了野生型BRD4 WT-BD2-CPS和WT-BD1-BD2蛋白质(图3.2A),显微镜下显示WT-BD2-CPS以及WT-BD1-BD2蛋白质的液-液相分离的液滴,但较EGFP-BRD4融合蛋白质(EGFP-BD2-CPS、EGFP-BD1-BD2)形成的液滴较弱(图3.2B),可能是由于EGFP增加了蛋白质分子氨基酸序列的长度,相对蛋白质分子体积更大,增加了蛋白质分子间多共价作用,促进液态相分离的形成。
为了确定BRD4短亚型蛋白质形成液滴的关键氨基酸序列,我们表达纯化了含EGFP荧光标签的两段BRD4S截短型蛋白质EGFP-BD2-CPS(347-720)和EGFP-BD1-BD2(44-477)(图3.2A)。结果显示,EGFP-BD2-CPS和EGFP-BD1-BD2蛋白质在室温及低盐条件下均可形成球状的液-液相分离的液滴,而EGFP-BD1-BD2的相分离液滴与EGFP-BD2-CPS的液滴相比数量较少,体积较小(图3.2B)。EGFP-BD2-CPS和EGFP-BD1-BD2蛋白质的液滴在加入2%的PEG-6000前后未见明显变化,说明BRD4S蛋白质片段无需PEG-6000就能够形成液相分离;游离的EGFP标签蛋白质分子分别在有无PEG-6000条件下均呈澄清状态(图3.2C),未见EGFP标签蛋白质对BRD4S蛋白质的液滴形成的影响。为了进一步证明BRD4S蛋白质形成的液-液相分离并非由EGFP导致,我们纯化了野生型BRD4 WT-BD2-CPS和WT-BD1-BD2蛋白质(图3.2A),显微镜下显示WT-BD2-CPS以及WT-BD1-BD2蛋白质的液-液相分离的液滴,但较EGFP-BRD4融合蛋白质(EGFP-BD2-CPS、EGFP-BD1-BD2)形成的液滴较弱(图3.2B),可能是由于EGFP增加了蛋白质分子氨基酸序列的长度,相对蛋白质分子体积更大,增加了蛋白质分子间多共价作用,促进液态相分离的形成。为了验证BRD4S蛋白质液滴的相分离特性,我们检测了EGFP-BD2-CPS和EGFP-BD1-BD2蛋白质在不同蛋白质及盐浓度条件下的LLPS。结果显示,这两种蛋白质形成的液滴均随蛋白质浓度的增加而增强,随盐离子强度(NaCl浓度)的增加而减弱(图3.3A,B)。例如:EGFP-BD2-CPS在体外条件下形成的LLPS,在盐浓度50-350 mM及蛋白质浓度5-60μM范围内,对溶液盐浓度及蛋白质浓度变化呈依赖性,随蛋白质浓度的增加而增强,随盐离子强度(NaCl浓度)的增加而减弱(图3.3C)。
本文编号：3043058
【文章来源】：吉林大学吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：82 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
液-液相分离受多种因素影响[42]
研究报道,BRD4L蛋白质长亚型的C-末端能够与介导蛋白Med1在超级增强子区域形成液-液相分离[89],为了研究BRD4S或者BRD4L的N末端氨基酸序列是否具有形成液-液相分离的能力,我们在体外表达纯化了BRD4S(1-719),并且用荧光标签Alexa-Fluor 488进行标记。荧光共聚焦显微镜下观察到,在体外低盐条件下(65 mM NaCl,2%PEG-6000),BRD4S(1-719)在0.5μM蛋白质浓度形成液-液相分离的液滴(图3.1A)。并且,随着BRD4S(1-719)蛋白质浓度的增加,其形成的相分离的液滴的数量及总面积均相应增加,这说明BRD4S(1-719)在体外条件下形成的液-液相分离具有浓度依赖性(图3.1B)。为了确定BRD4短亚型蛋白质形成液滴的关键氨基酸序列,我们表达纯化了含EGFP荧光标签的两段BRD4S截短型蛋白质EGFP-BD2-CPS(347-720)和EGFP-BD1-BD2(44-477)(图3.2A)。结果显示,EGFP-BD2-CPS和EGFP-BD1-BD2蛋白质在室温及低盐条件下均可形成球状的液-液相分离的液滴,而EGFP-BD1-BD2的相分离液滴与EGFP-BD2-CPS的液滴相比数量较少,体积较小(图3.2B)。EGFP-BD2-CPS和EGFP-BD1-BD2蛋白质的液滴在加入2%的PEG-6000前后未见明显变化,说明BRD4S蛋白质片段无需PEG-6000就能够形成液相分离;游离的EGFP标签蛋白质分子分别在有无PEG-6000条件下均呈澄清状态(图3.2C),未见EGFP标签蛋白质对BRD4S蛋白质的液滴形成的影响。为了进一步证明BRD4S蛋白质形成的液-液相分离并非由EGFP导致,我们纯化了野生型BRD4 WT-BD2-CPS和WT-BD1-BD2蛋白质(图3.2A),显微镜下显示WT-BD2-CPS以及WT-BD1-BD2蛋白质的液-液相分离的液滴,但较EGFP-BRD4融合蛋白质(EGFP-BD2-CPS、EGFP-BD1-BD2)形成的液滴较弱(图3.2B),可能是由于EGFP增加了蛋白质分子氨基酸序列的长度,相对蛋白质分子体积更大,增加了蛋白质分子间多共价作用,促进液态相分离的形成。
为了确定BRD4短亚型蛋白质形成液滴的关键氨基酸序列,我们表达纯化了含EGFP荧光标签的两段BRD4S截短型蛋白质EGFP-BD2-CPS(347-720)和EGFP-BD1-BD2(44-477)(图3.2A)。结果显示,EGFP-BD2-CPS和EGFP-BD1-BD2蛋白质在室温及低盐条件下均可形成球状的液-液相分离的液滴,而EGFP-BD1-BD2的相分离液滴与EGFP-BD2-CPS的液滴相比数量较少,体积较小(图3.2B)。EGFP-BD2-CPS和EGFP-BD1-BD2蛋白质的液滴在加入2%的PEG-6000前后未见明显变化,说明BRD4S蛋白质片段无需PEG-6000就能够形成液相分离;游离的EGFP标签蛋白质分子分别在有无PEG-6000条件下均呈澄清状态(图3.2C),未见EGFP标签蛋白质对BRD4S蛋白质的液滴形成的影响。为了进一步证明BRD4S蛋白质形成的液-液相分离并非由EGFP导致,我们纯化了野生型BRD4 WT-BD2-CPS和WT-BD1-BD2蛋白质(图3.2A),显微镜下显示WT-BD2-CPS以及WT-BD1-BD2蛋白质的液-液相分离的液滴,但较EGFP-BRD4融合蛋白质(EGFP-BD2-CPS、EGFP-BD1-BD2)形成的液滴较弱(图3.2B),可能是由于EGFP增加了蛋白质分子氨基酸序列的长度,相对蛋白质分子体积更大,增加了蛋白质分子间多共价作用,促进液态相分离的形成。为了验证BRD4S蛋白质液滴的相分离特性,我们检测了EGFP-BD2-CPS和EGFP-BD1-BD2蛋白质在不同蛋白质及盐浓度条件下的LLPS。结果显示,这两种蛋白质形成的液滴均随蛋白质浓度的增加而增强,随盐离子强度(NaCl浓度)的增加而减弱(图3.3A,B)。例如:EGFP-BD2-CPS在体外条件下形成的LLPS,在盐浓度50-350 mM及蛋白质浓度5-60μM范围内,对溶液盐浓度及蛋白质浓度变化呈依赖性,随蛋白质浓度的增加而增强,随盐离子强度(NaCl浓度)的增加而减弱(图3.3C)。
本文编号：3043058
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/jiyingongcheng/3043058.html
最近更新
教材专著
