蛇PLIγ基因改组和高活性突变体筛选

发布时间：2021-02-21 00:03

　　磷脂酶A₂（PLA₂）是蛇毒中的重要毒素,具有神经毒、肌肉毒、血液毒性等,并可以引起严重的炎症反应。蛇血清中存在蛇毒PLA₂天然抑制蛋白（PLA₂inhibitor,PLI）,可以保护蛇机体免于中毒。其中γ型PLI是分布最广、报道最多的PLI。PLIγ在有毒蛇和无毒蛇中均有表达,但不同的蛇源PLIγ抗毒活性有较大的差异,具体原因尚不清楚。目前研究报道的PLIγ仅停留在从蛇血液中分离纯化以及活性的证明上,对结构的研究不多。本文以两种高活性的华游蛇PLIγ（SaPLIγ）和王锦蛇的PLIγ（EcPLIγ）为亲本,采取DNA改组的方法,将两种PLIγ进行基因重组,利用噬菌体表面展示技术淘选高活性的改组PLIγ。目的:通过基因改组的定向进化策略和噬菌体表面展示技术,对PLIγ进行改组并筛选获得更高活性的PLIγ,探讨关键氨基酸序列、局部结构与PLIγ活性的关系。方法:（1）取新鲜的华游蛇、王锦蛇肝脏,提取RNA,逆转录获得cDNA,利用简并引物进行PCR扩增,得到两种亲本PLIγ基因,并测序。（2）将SaP... 

【文章来源】：南昌大学江西省 211工程院校

【文章页数】：74 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

基因改组原理图

图 2 DNA 改组过程中产物的检测与华游蛇 PLIγ 电泳鉴定. M:100 bp DNA Marker，1.王锦蛇 PLIγ，2.华游蛇 PLLIγ 水解产物琼脂糖电泳。M:50bp DNA Marker。c.无引物 PCR 扩增产物电p DNA Marker。d.PLIγ 有引物 PCR 扩增，获得了大小为 550bp 条带。M:100bp DCANTAB5e-cPLIγ 重组载体验证改组的 cPLIγ 和噬菌粒载体 pCANTAB5e 先后经过 sfi I 和 Not I 双酶 T4 连接酶连接，连接好的重组质粒转化到大肠杆菌 TG1 感受态细胞 均匀涂到 YT-A 固体培养基上，随机挑取 10 个单克隆菌落扩大培养 和双酶切鉴定，结果见图 3。十个单克隆菌落 PCR 表明均为阳性克隆（酶切鉴定可以看到有 4500bp 和 550bp 两个条带，Not I 单酶切泳道（泳道）仅一个条带，分子量约为 5000bp，结果表明质粒构建成功，初可以用于后续噬菌体的筛选。

进行 PCR 和双酶切鉴定，结果见图 3。十个单克隆菌落 PCR 表明均为阳性克隆（图3A）。双酶切鉴定可以看到有 4500bp 和 550bp 两个条带，Not I 单酶切泳道（图3B 第四泳道）仅一个条带，分子量约为 5000bp，结果表明质粒构建成功，初级基因库可以用于后续噬菌体的筛选。图 3 重组质粒的 PCR 和酶切验证AB→500bpA：重组质粒 PCR 鉴定。菌落 PCR 产物与理论值相符。B：重组质粒酶切鉴定。M， 1kb DNAMarker，1-3 Sfi I 和 Not I 双酶切结果，4，Not I 单酶切结果。

【参考文献】：
期刊论文
[1]华游蛇PLIγ模拟肽的设计与活性验证[J]. 钟立鹏,郭薇,姚敏,沈婷,杨武,黄春洪.  基础医学与临床. 2014(03)
[2]基于Autodock和蛇PLIγ设计短肽sPLA2抑制剂[J]. 钟立鹏,姚敏,乐贞,黄春洪.  南昌大学学报(理科版). 2013(04)
[3]蛋白质定向进化技术的研究进展[J]. 苏怡丹,伍宁丰,刘国安.  生物技术通报. 2009(11)
[4]DNA改组及其应用研究[J]. 赵翠燕,许钦坤,柯野.  当代生态农业. 2009(Z1)
[5]乌梢蛇血清对白眉蝮等3种蛇毒解毒作用初探[J]. 胡恺,万新华,刘岱岳.  蛇志. 2006(03)
[6]王锦蛇血清对尖吻蝮蛇毒的抑制作用[J]. 黄松,黄接棠.  蛇志. 2005(04)
[7]利用DNA家族重排提高青霉素G酰化酶合成活力（英文）[J]. 周政,张爱晖,王晶茹,陈茂林,李仁宝,杨晟,袁中一.  生物化学与生物物理学报. 2003(06)



本文编号：3043548