基于CRISPR/dCas9技术的基因转录激活与DNA靶向富集新方法研究

发布时间：2021-02-27 14:54

　　本研究以CRISPR/dCas9技术为基础,在sgRNA的3′端添加长度为24 bp的捕获序列使之成为捕获sgRNA（Capture sgRNA,csgRNA）,与dCas9形成复合物后,csgRNA可以指导dCas9寻靶并结合到目标序列上。利用碱基互补的原理,dCas9-csgRNA复合物上的捕获序列可以与带有互补单链的线性DNA片段发生互作,从而实现了以下实验目的:（1）将带有互补单链的线性CMV片段锚定到目标基因的启动子区,使之以反式增强子（Trans enhancer）的方式实现对目标基因的转录激活,使目标基因表达水平增高,实现特定的细胞生物学目的;（2）使用dCas9-csgRNA复合物在体外靶向结合目标DNA序列,然后借助带有互补单链线性DNA片段的磁珠富集目标DNA后建库测序;（3）使用dCas9-csgRNA复合物在细胞内靶向结合目的DNA（启动子）,然后借助带有互补单链线性DNA片段的磁珠富集参与调控目标基因调控的调控序列和转录调节因子。本论文研究内容分为以下三个部分:1.用反式增强子方法实现对目标基因的转录激活从pEGFP-N1载体上扩增出平末端CMV序列（blun... 

【文章来源】：东南大学江苏省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：130 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 绪论
    1.1 CRISPR/Cas系统介绍
        1.1.1 CRISPR/Cas系统的来源和分类
        1.1.2 CRISPR/Cas系统的应用和研究进展
        1.1.3 CRISPR/Cas9 系统的改进和应用拓展
    1.2 基因转录调控及其治疗价值
        1.2.1 基因转录调控紊乱与疾病的关系
        1.2.2 基因表达调控紊乱的成因
        1.2.3 基因转录调控的实现方法和应用前景
    1.3 转录调控和基因突变对肿瘤发生的影响
        1.3.1 癌基因的过度活化
        1.3.2 抑癌基因的异常表达
        1.3.3 转录调控与靶向医疗
        1.3.4 一些重要的肿瘤基因
    1.4 研究意义和内容
第2章 反式增强子特异性激活目标基因转录
    2.1 引言
    2.2 材料与方法
        2.2.1 主要实验材料及仪器
    2.3 载体构建
        2.3.1 dCas9和sgRNA表达载体的构建
        2.3.2 与csgRNA捕获序列互补结合的sCMV片段的制备方法
        2.3.3 sgRNA的改造及其功能验证
    2.4细胞培养与转染实验
        2.4.1 反式增强子原理验证
        2.4.2 对比不同转录激活方法对目标基因的激活效果
        2.4.3 对比不同转录激活方法在多种细胞的激活效果
        2.4.4 激活HNF4a基因转录表达后对HepG2 细胞侵袭能力的影响
        2.4.5 HepG2 细胞激活HNF4a后对迁移能力的影响
        2.4.6 激活HNF4a后对HepG2 细胞功能基因的影响
        2.4.7 激活E47 后对PANC-1 细胞的影响
    2.5 结果
        2.5.1 使用CRISPR辅助的反式增强子激活目标基因
        2.5.2 捕获序列对sgRNA功能的影响
        2.5.3 使用反式增强子激活外源报告载体
        2.5.4 反式增强子与VPR的转录效果比较
        2.5.5 反式增强子方法激活内源基因转录表达
        2.5.6 使用反式增强子激活肿瘤细胞分化基因
        2.5.7 由VPR和 CMV组成的反式增强子激活内源基因
    2.6 本章小结
第3章 csgRNA体外靶向富集目标区域
    3.1 引言
    3.2 材料和方法
        3.2.1 主要仪器和材料
        3.2.2 细胞培养和提取总DNA
        3.2.3 Tn5 酶切基因组和片段回收
        3.2.4 制备csgRNA
        3.2.5 目标片段的靶向富集和建库测序
        3.2.6 测序结果分析
        3.2.7 比较不同数量csgRNA组合对富集结果的影响
        3.2.8 从模拟混合样品的富集突变序列
    3.3 结果和讨论
        3.3.1 原理示意图
        3.3.2 Tn5 酶切基因组和片段回收
        3.3.3 基因组样品的靶向富集和建库测序
        3.3.4 比较293T和293Tm样品的测序结果
        3.3.5 各种细胞系所属的突变
        3.3.6 模拟混合样品的靶向富集
    3.4 小结
第4章 csgRNA靶向富集调控序列和转录因子
    4.1 引言
    4.2 材料和方法
        4.2.1 主要试剂材料及仪器
        4.2.2 载体构建
        4.2.3 细胞培养和转染
        4.2.4 甲醛交联、染色质片段化和富集目标序列
        4.2.5 磁珠的包被和目标序列的捕获
        4.2.6 核酸建库和蛋白样品处理
        4.2.7 测序结果分析
        4.2.8 质谱结果分析
        4.2.9 基因组转录因子结合位点预测与筛选
    4.3 结果和讨论
        4.3.1 原理示意图
        4.3.2 核酸建库检测
        4.3.3 核酸样品的测序结果
        4.3.4 调控序列的模体分析
        4.3.5 蛋白质谱结果
    4.4 小结
第5章 总结与展望
参考文献
作者简介
    个人履历
    攻读博士学位期间参与的科研项目
    攻读博士学位期间已发表及投稿中的学术论文、申报的专利
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]Modeling the causal regulatory network by integrating chromatin accessibility and transcriptome data[J]. Yong Wang,Rui Jiang,Wing Hung Wong.  National Science Review. 2016(02)
[2]Sox2, a key factor in the regulation of pluripotency and neural differentiation[J]. Shuchen Zhang,Wei Cui.  World Journal of Stem Cells. 2014(03)
[3]Embryonic stem cell factors and pancreatic cancer[J]. Marta Herreros-Villanueva,Luis Bujanda,Daniel D Billadeau,Jin-San Zhang.  World Journal of Gastroenterology. 2014(09)



本文编号：3054395