耐草甘膦转基因大豆的获得及部分环境安全性研究
发布时间：2021-02-28 07:33
豆田杂草严重限制大豆产量和品质的提高,草甘膦的广谱灭生性特点限制了它在作物田间的应用。生物技术生产的抗草甘膦转基因作物允许农民使用草甘膦控制杂草。为获得具有我国自主知识产权的转基因大豆,本研究将G10-EPSPS基因通过农杆菌介导法导入大豆品种中豆32中,获得高抗草甘膦的转基因大豆。通过对转基因大豆后代的分子检测,田间草甘膦抗性鉴定,转录组测序、对生物多样性的影响分析,以及转基因大豆的营养成分进行分析,得到以下结果:1.Southern结果表明G10-EPSPS基因已成功整合进大豆基因组中,并为单拷贝插入。Western及Elisa结果表明G10-EPSPS蛋白在转基因植株的根、茎、叶、花、荚皮和种子中均有表达。叶片中G10-EPSPS蛋白的含量最高。结荚期叶片中外源蛋白的含量显著高于苗期。大豆籽粒中外源蛋白含量最低。转基因大豆不同世代（T7、T8、T9）叶片及种子中G10-EPSPS蛋白的含量没有显著差异,外源蛋白在不同世代间的表达稳定。田间试验表明,该转基因大豆能耐受高浓度的草甘膦。T1代对草甘...
【文章来源】：上海交通大学上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：111 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
pSOY19质粒图
上海交通大学博士学位论文第2章37图2-2.大豆改进的半粒法遗传转化步骤注：(a)半种子用农杆菌侵染30分钟；(b)半种子和农杆菌在共培养培养基上培养4天；(c)外植体在芽诱导培养基上生长14天；(d)切掉上部1/3子叶的外植体在新鲜的芽诱导培养基上生长14天；(e)从伸长培养基上长出伸长芽；(f)伸长芽在1/2MS培养基上生根；(g)来自于一个外植体的几个转化体；(h)转化植株结实情况。Fig.2-2.StepsoftheimprovedhalfseedstransformationsysteminsoybeanNote：(a)half-seedswereinfectedwithAgrobacteriumfor30min.(b)half-seedsandAgrobacteriumwereco-culturedonco-culturemediumfor4days.(c)explantswereculturedonSImediumfor14days.(d)explantswerecutby1/3toppartandtransferredonfreshSImediumfor14days.(e)shootswereregeneratingfromexplantsinSEmedium.(f)shootswererootingin1/2MSmedium.(g)genetictransformationplantsobtainedfromoneexplant.(h)podssettingoftransformationsoybeanplant.2.3.2转基因大豆的分子检测2.3.2.1PCR检测对来自一个外植体的4株T0代大豆植株用CTAB法少量提取植物基因组DNA，PCR结果显示所检测的4株植株均为阳性（图2-3）。
上海交通大学博士学位论文第2章38图2-3.T0代植株PCR结果注：泳道1：Marker;泳道2：阴性非转基因对照植株；泳道3-6：阳性转基因植株；泳道7：ddH2O；泳道8：阳性对照质粒。Fig.2-3.PCRresultsoftheT0generationplantsNote：Lane1:Marker;Lane2:NegativeCKplant;Lane3-6:PCRpositivetransformationplant;Lane7:ddH2O;Lane8:PositiveplasmidCK.2.3.2.2Southern分析采用XbaI，HindIII，EcoRI酶切大豆基因组DNA，与地高辛标记的G10-EPSPS基因片段制作的探针杂交，结果显示（图2-4）G10-EPSPS基因已成功整合进入大豆基因组中，并为单拷贝插入。图2-4.T1代植株SouthernBlot分析注:泳道1:阳性质粒DNA用XbaI酶切；泳道2:阴性非转基因植株DNA用XbaI酶切；泳道3-5:阳性转基因植株DNA用EcoRI,HindIII,XbaI酶切.Fig.2-4.SouthernblotanalysisofT1generationplant.Note:Lane1:positivecontrolplasmidDNAdigestedwithXbaI;Lane2:non-transformednegativecontrolplantgenomicDNAdigestedwithXbaI;Lane3-5:positivetransgenicplantgenomicDNAdigestedwithEcoRI,HindIII,XbaI.2.3.2.3EPSPS基因的实时定量表达（qRT-PCR）各组织G10-EPSPS基因在RNA水平上的表达情况如图2-5：
【参考文献】：
期刊论文
[1]转基因大豆SHZD32-01对草甘膦的抗性及草甘膦除草效果研究[J]. 李娜,曹越平. 大豆科学. 2018(03)
[2]干旱胁迫下转基因抗旱大豆与不同碳代谢途径杂草生存竞争的研究[J]. 王靖宇,丁伟,Muhammad Shahid Khan,程茁,戴航宇. 江苏农业科学. 2018(03)
[3]抗虫基因Cry1Iem转化大豆的研究[J]. 何欢,高嵩,韩丹,吴楠,曲静,王丕武. 吉林农业大学学报. 2017(06)
[4]水稻抗咪唑啉酮类除草剂基因ALS功能标记的开发与应用[J]. 王芳权,杨杰,范方军,李文奇,王军,许扬,朱金燕,费云燕,仲维功. 作物学报. 2018(03)
[5]杂草环境下转EPSPS基因大豆NZL06-698的生态适应性研究[J]. 黄鹞,郭汝清,刘标. 大豆科学. 2017(06)
[6]转基因抗虫、耐除草剂复合性状玉米SK12-5生存竞争能力评价[J]. 谢彦博,谭喜昌,邢珍娟,李葱葱,李飞武,刘娜. 玉米科学. 2017(05)
[7]国内外抗除草剂基因专利的分析[J]. 张玉池,王晓蕾,徐文蓉,刘琪,相世刚,戴伟民,强胜,宋小玲. 杂草学报. 2017(02)
[8]耐盐碱转基因大豆（SRTS）生存竞争能力评价[J]. 刘琦,夏善勇,刘昭军,谭巍巍,刘鑫磊,吴滨,李希臣. 大豆科学. 2017(03)
[9]乙酰乳酸合成酶及ALS基因研究概述[J]. 任洪雷. 中国农学通报. 2016(26)
[10]抗草甘膦转基因大豆的抗性及栽培地生存竞争能力研究[J]. 张家进,武湘豫,曹越平. 上海交通大学学报(农业科学版). 2017(04)
博士论文
[1]杂交水稻参与杂草稻起源的证据及抗除草剂转基因水稻生态风险研究[D]. 张晶旭.南京农业大学 2015
[2]转G2-aroA基因抗草甘膦棉花植株的获得及特异性检测[D]. 张小兵.中国农业科学院 2015
[3]牛筋草（Eleusine indica （L.）Gaertn.）对草甘膦的抗药性[D]. 陈景超.中国农业科学院 2015
[4]新型转基因抗草甘膦玉米的培育及转基因玉米安全控制技术的研究[D]. 李京.浙江大学 2013
[5]大豆植株再生和遗传转化技术体系的研究[D]. 杨超.南京农业大学 2009
硕士论文
[1]转g10evo基因抗草甘膦大豆的研究[D]. 谭苗苗.浙江大学 2016
本文编号：3055532
【文章来源】：上海交通大学上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：111 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
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上海交通大学博士学位论文第2章37图2-2.大豆改进的半粒法遗传转化步骤注：(a)半种子用农杆菌侵染30分钟；(b)半种子和农杆菌在共培养培养基上培养4天；(c)外植体在芽诱导培养基上生长14天；(d)切掉上部1/3子叶的外植体在新鲜的芽诱导培养基上生长14天；(e)从伸长培养基上长出伸长芽；(f)伸长芽在1/2MS培养基上生根；(g)来自于一个外植体的几个转化体；(h)转化植株结实情况。Fig.2-2.StepsoftheimprovedhalfseedstransformationsysteminsoybeanNote：(a)half-seedswereinfectedwithAgrobacteriumfor30min.(b)half-seedsandAgrobacteriumwereco-culturedonco-culturemediumfor4days.(c)explantswereculturedonSImediumfor14days.(d)explantswerecutby1/3toppartandtransferredonfreshSImediumfor14days.(e)shootswereregeneratingfromexplantsinSEmedium.(f)shootswererootingin1/2MSmedium.(g)genetictransformationplantsobtainedfromoneexplant.(h)podssettingoftransformationsoybeanplant.2.3.2转基因大豆的分子检测2.3.2.1PCR检测对来自一个外植体的4株T0代大豆植株用CTAB法少量提取植物基因组DNA，PCR结果显示所检测的4株植株均为阳性（图2-3）。
上海交通大学博士学位论文第2章38图2-3.T0代植株PCR结果注：泳道1：Marker;泳道2：阴性非转基因对照植株；泳道3-6：阳性转基因植株；泳道7：ddH2O；泳道8：阳性对照质粒。Fig.2-3.PCRresultsoftheT0generationplantsNote：Lane1:Marker;Lane2:NegativeCKplant;Lane3-6:PCRpositivetransformationplant;Lane7:ddH2O;Lane8:PositiveplasmidCK.2.3.2.2Southern分析采用XbaI，HindIII，EcoRI酶切大豆基因组DNA，与地高辛标记的G10-EPSPS基因片段制作的探针杂交，结果显示（图2-4）G10-EPSPS基因已成功整合进入大豆基因组中，并为单拷贝插入。图2-4.T1代植株SouthernBlot分析注:泳道1:阳性质粒DNA用XbaI酶切；泳道2:阴性非转基因植株DNA用XbaI酶切；泳道3-5:阳性转基因植株DNA用EcoRI,HindIII,XbaI酶切.Fig.2-4.SouthernblotanalysisofT1generationplant.Note:Lane1:positivecontrolplasmidDNAdigestedwithXbaI;Lane2:non-transformednegativecontrolplantgenomicDNAdigestedwithXbaI;Lane3-5:positivetransgenicplantgenomicDNAdigestedwithEcoRI,HindIII,XbaI.2.3.2.3EPSPS基因的实时定量表达（qRT-PCR）各组织G10-EPSPS基因在RNA水平上的表达情况如图2-5：
【参考文献】：
期刊论文
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[4]水稻抗咪唑啉酮类除草剂基因ALS功能标记的开发与应用[J]. 王芳权,杨杰,范方军,李文奇,王军,许扬,朱金燕,费云燕,仲维功. 作物学报. 2018(03)
[5]杂草环境下转EPSPS基因大豆NZL06-698的生态适应性研究[J]. 黄鹞,郭汝清,刘标. 大豆科学. 2017(06)
[6]转基因抗虫、耐除草剂复合性状玉米SK12-5生存竞争能力评价[J]. 谢彦博,谭喜昌,邢珍娟,李葱葱,李飞武,刘娜. 玉米科学. 2017(05)
[7]国内外抗除草剂基因专利的分析[J]. 张玉池,王晓蕾,徐文蓉,刘琪,相世刚,戴伟民,强胜,宋小玲. 杂草学报. 2017(02)
[8]耐盐碱转基因大豆（SRTS）生存竞争能力评价[J]. 刘琦,夏善勇,刘昭军,谭巍巍,刘鑫磊,吴滨,李希臣. 大豆科学. 2017(03)
[9]乙酰乳酸合成酶及ALS基因研究概述[J]. 任洪雷. 中国农学通报. 2016(26)
[10]抗草甘膦转基因大豆的抗性及栽培地生存竞争能力研究[J]. 张家进,武湘豫,曹越平. 上海交通大学学报(农业科学版). 2017(04)
博士论文
[1]杂交水稻参与杂草稻起源的证据及抗除草剂转基因水稻生态风险研究[D]. 张晶旭.南京农业大学 2015
[2]转G2-aroA基因抗草甘膦棉花植株的获得及特异性检测[D]. 张小兵.中国农业科学院 2015
[3]牛筋草（Eleusine indica （L.）Gaertn.）对草甘膦的抗药性[D]. 陈景超.中国农业科学院 2015
[4]新型转基因抗草甘膦玉米的培育及转基因玉米安全控制技术的研究[D]. 李京.浙江大学 2013
[5]大豆植株再生和遗传转化技术体系的研究[D]. 杨超.南京农业大学 2009
硕士论文
[1]转g10evo基因抗草甘膦大豆的研究[D]. 谭苗苗.浙江大学 2016
本文编号：3055532
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