HBx基因对小鼠肝脏细胞凋亡和周期影响的体内研究
发布时间：2021-03-04 09:35
目的:构建KM小鼠HBx（Hepatitis B virus X）表达模型,探讨HBx对正常免疫功能小鼠肝脏细胞凋亡和周期的影响及其机制。方法:观察肝前体细胞株（hepatic progenitor cells,HPCs）中慢病毒的转染情况,qRT-PCR和Western blotting方法检测HBx在肝前体细胞中的表达;将表达HBx的肝前体细胞经肝门静脉注射到KM小鼠体内建立动物模型,于手术后60天、90天和120天观察小鼠肝脏组织中EGFP的表达,使用qRT-PCR、Western blotting和免疫组化的方法检测小鼠肝脏组织中HBx的表达;检测小鼠肝脏细胞凋亡和周期相关因子以及Akt/mTOR信号通路因子的mRNA和蛋白表达水平;采用TUNEL-FITC/DAPI方法检测小鼠肝脏细胞的凋亡率。结果:HBx-EGFP-14-19组小鼠肝脏细胞的凋亡率显著降低,促凋亡因子caspase-9和Bad的mRNA和蛋白表达均下调,而抗凋亡因子Bcl-xl的mRNA和蛋白表达上调;CDK2、cyclinD1和cyclinE的mRNA表达水平较对照组上调,CDK2、cyclinD1、cy...
【文章来源】：重庆医科大学重庆市
【文章页数】：65 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
肝前体细胞株中HBx的表达A：肝前体细胞株EGFP的表达
取小鼠肝脏组织冰冻切片：EGFP-14-19 60 天、EGFP-14-19 90 天、EGFP-14-19120 天、HBx-EGFP-14-19 60 天、HBx-EGFP-14-19 90 天和 HBx-EGFP-14-19 120天。荧光显微镜观察并成像，结果显示，小鼠肝脏组织切片均有荧光表达(图 1.2)，说明 HBx 蛋白在肝脏中稳定表达。采用 qRT-PCR 和 Western blotting 检测 5 组肝脏组织 HBx 的表达情况。结果表明，与 EGFP-14-19 组和生理盐水组小鼠肝脏组织相比，HBx-EGFP-14-19 组小鼠肝脏组织有 HBx 表达(图 1.3A，B)。采用免疫组化法检测三组肝脏组织中 HBx 蛋白的表达，结果显示 HBx-EGFP-14-19 组小鼠肝脏组织有 HBx 的阳性染色，且细胞质内及细胞膜中均能观察到棕黄色染色，而生理盐水组与 EGFP-14-19 组未见阳性染色，表明 HBx 在小鼠肝脏中成功表达(图 1.3C)。以上结果表明稳定表达 HBx 的小鼠模型构建成功，为研究 HBx 在体内的功能奠定了基础。
图 1.3 小鼠肝脏组织中 HBx 的表达A：Western blotting 法检测小鼠肝脏细胞中 HBx 蛋白的表达。B：qRT-PCR 法检测小鼠肝脏细胞中 HBx mRNA 的表达。C：免疫组化法检测小鼠肝脏组织中 HBx 蛋白表达（200×）。**：P<0.01，与生理盐水组、EGFP-14-19 组比较。（I:生理盐水组；II:EGFP-14-19 组；III:HBx-EGFP-14-19 60 天组；IV: HBx-EGFP-14-19 90 天组；V:HBx-EGFP-14-19 120 天组）Fig. 1.3 Expression of HBx in mouse liver tissuesA: The protein expression of HBx in mouse liver cells was detected by Western blotting. B: ThemRNA expression of HBx in mouse liver cells was detected by qRT-PCR. C: The proteinexpression of HBx in mouse liver tissues was detected by immunohistochemistry (200×).**:P<0.01, compared with normal saline and EGFP-14-19 group. (I: normal saline group; II:EGFP-14-19 group; III: HBx-EGFP-14-19 60 day group; IV: HBx-EGFP-14-19 90 day group;V: HBx-EGFP-14-19 120 day group)4 讨论
【参考文献】：
期刊论文
[1]HBx基因抑制肝前体细胞凋亡与分化的小鼠体内研究[J]. 霍本念,刘洁,王薛,张婷,刘梦楠,冯涛. 第三军医大学学报. 2018(05)
[2]稳定表达HBx的肝前体细胞株的构建及其对增殖的影响[J]. 芦永良,申利红,李红丽,胡代曦,张锡峰,胡斌,冯涛,黄佳祎. 细胞与分子免疫学杂志. 2013(03)
[3]乙肝病毒X蛋白对肝前体细胞分化的影响[J]. 白光文,申利红,卢永良,李红丽,冯涛,黄佳祎. 重庆医科大学学报. 2012(10)
[4]HBx activates FasL and mediates HepG2 cell apoptosis through MLK3-MKK7-JNKs signal module[J]. Ren-Xian Tang,Fan-Yun Kong,Bao-Feng Fan,Xiao-Mei Liu,Hong-Juan You,Peng Zhang,Kui-Yang Zheng ,Department of Pathogenic Biology and Lab of Infection and Immunology,Xuzhou Medical College,Xuzhou 221002,Jiangsu Province,China. World Journal of Gastroenterology. 2012(13)
本文编号：3062984
【文章来源】：重庆医科大学重庆市
【文章页数】：65 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
肝前体细胞株中HBx的表达A：肝前体细胞株EGFP的表达
取小鼠肝脏组织冰冻切片：EGFP-14-19 60 天、EGFP-14-19 90 天、EGFP-14-19120 天、HBx-EGFP-14-19 60 天、HBx-EGFP-14-19 90 天和 HBx-EGFP-14-19 120天。荧光显微镜观察并成像，结果显示，小鼠肝脏组织切片均有荧光表达(图 1.2)，说明 HBx 蛋白在肝脏中稳定表达。采用 qRT-PCR 和 Western blotting 检测 5 组肝脏组织 HBx 的表达情况。结果表明，与 EGFP-14-19 组和生理盐水组小鼠肝脏组织相比，HBx-EGFP-14-19 组小鼠肝脏组织有 HBx 表达(图 1.3A，B)。采用免疫组化法检测三组肝脏组织中 HBx 蛋白的表达，结果显示 HBx-EGFP-14-19 组小鼠肝脏组织有 HBx 的阳性染色，且细胞质内及细胞膜中均能观察到棕黄色染色，而生理盐水组与 EGFP-14-19 组未见阳性染色，表明 HBx 在小鼠肝脏中成功表达(图 1.3C)。以上结果表明稳定表达 HBx 的小鼠模型构建成功，为研究 HBx 在体内的功能奠定了基础。
图 1.3 小鼠肝脏组织中 HBx 的表达A：Western blotting 法检测小鼠肝脏细胞中 HBx 蛋白的表达。B：qRT-PCR 法检测小鼠肝脏细胞中 HBx mRNA 的表达。C：免疫组化法检测小鼠肝脏组织中 HBx 蛋白表达（200×）。**：P<0.01，与生理盐水组、EGFP-14-19 组比较。（I:生理盐水组；II:EGFP-14-19 组；III:HBx-EGFP-14-19 60 天组；IV: HBx-EGFP-14-19 90 天组；V:HBx-EGFP-14-19 120 天组）Fig. 1.3 Expression of HBx in mouse liver tissuesA: The protein expression of HBx in mouse liver cells was detected by Western blotting. B: ThemRNA expression of HBx in mouse liver cells was detected by qRT-PCR. C: The proteinexpression of HBx in mouse liver tissues was detected by immunohistochemistry (200×).**:P<0.01, compared with normal saline and EGFP-14-19 group. (I: normal saline group; II:EGFP-14-19 group; III: HBx-EGFP-14-19 60 day group; IV: HBx-EGFP-14-19 90 day group;V: HBx-EGFP-14-19 120 day group)4 讨论
【参考文献】：
期刊论文
[1]HBx基因抑制肝前体细胞凋亡与分化的小鼠体内研究[J]. 霍本念,刘洁,王薛,张婷,刘梦楠,冯涛. 第三军医大学学报. 2018(05)
[2]稳定表达HBx的肝前体细胞株的构建及其对增殖的影响[J]. 芦永良,申利红,李红丽,胡代曦,张锡峰,胡斌,冯涛,黄佳祎. 细胞与分子免疫学杂志. 2013(03)
[3]乙肝病毒X蛋白对肝前体细胞分化的影响[J]. 白光文,申利红,卢永良,李红丽,冯涛,黄佳祎. 重庆医科大学学报. 2012(10)
[4]HBx activates FasL and mediates HepG2 cell apoptosis through MLK3-MKK7-JNKs signal module[J]. Ren-Xian Tang,Fan-Yun Kong,Bao-Feng Fan,Xiao-Mei Liu,Hong-Juan You,Peng Zhang,Kui-Yang Zheng ,Department of Pathogenic Biology and Lab of Infection and Immunology,Xuzhou Medical College,Xuzhou 221002,Jiangsu Province,China. World Journal of Gastroenterology. 2012(13)
本文编号：3062984
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