三七bHLH转录因子与CAS RNAi协同作用对皂苷合成的影响
发布时间：2021-03-07 02:52
三七[Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen]为人参属药用植物,具有悠久的药用历史。三七皂苷（Panax notoginseng saponins,PNS）是三七主要的活性成分,在防治心脑血管疾病方面作用显著。由于三七药材为多年生植物,种植需要轮作,土地利用率低,因此有必要深入研究三七皂苷的生物合成调控技术,为利用合成生物学生产药用皂苷提供理论依据和技术基础。三七皂苷主要由甲羟戊酸（MVA）途径合成,该皂苷合成途径中,存在植物甾醇副产物合成支路,分流皂苷合成代谢流。因此,植物甾醇合成支路的第一个关键酶“环阿屯醇合成酶（cycloartenol synthase,CAS）”虽然不直接影响三七皂苷的合成,但由于它与达玛烯二醇合成酶（dammarenediol-II synthase,DS）共享合成皂苷的前体2,3-氧化鲨烯（2,3-oxidosqualene）,因此通过调控CAS表达,可以间接影响皂苷的合成。此外,我们的前期研究表明转录因子能够影响直接参与三七皂苷合成的关键酶基因的表达,进而实现对皂苷合成代谢流的调控。本研究利用转录因子独有的“多点调控”优势,同时...
【文章来源】：昆明理工大学云南省
【文章页数】：86 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
三七皂苷的生物合成途径（图中虚线表示多步酶促反应）
昆明理工大学硕士学位论文16筛选阳性单克隆菌液。将阳性菌液送生工生物公司测序，以获得正确的PnbHLH基因开放阅读框。2.3.4PnbHLH基因生物信息学分析DNAMAN软件用于进行DNA多重序列相似性比对；利用软件MEGA6.0构建Neighbor-joining系统进化树用于分析PnbHLH的系统发育多样性；PnbHLH基因编码蛋白的理化性质分析通过在线分析软件ExPASyBioinformaticsResourcePortal中的ProteomicsProtparam(http://www.expasy.ch/tools/protparam.html)完成；PnbHLH蛋白的二级结构通过软件PredictProtein(https://www.predictprotein.org/)进行预测，三维结构通过SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)进行预测。2.4结果与分析2.4.1三七细胞总RNA的提取和纯化通过完整的三七总RNA琼脂糖凝胶电泳检测发现，所提取的RNA条带均含有清晰的三条带，从上到下依次为28SrRNA、18SrRNA以及5SrRNA，且28SrRNA的条带亮度比18SrRNA条带亮(图2.1)；紫外分光光度计检测所提三七总RNA浓度发现A260/A280比值都在在1.8-2.0之间，这表明RNA中可能夹带蛋白等其他杂质，但浓度在该范围内仍旧可以用于后续实验的操作[49]；A260/A230比值均在2.08左右，说明所提取的三七总RNA质量较好，纯度较高。另外，水饱和酚有除蛋白的作用，氯仿可以有效去除蛋白和使有机相和水相分开，如果所提植物组织中存在蛋白等杂质含量较多的情况，可以在用苯酚氯仿抽提蛋白的步骤中适当重复一至两次进一步纯化RNA。图2.1三七总RNA琼脂糖凝胶电泳检测Fig.2.1AgarosegelelectrophoresisanalysisoftotalRNAofP.notoginseng
第二章三七PnbHLH转录因子基因的克隆与分析172.4.2克隆获得PnbHLH基因以上述所提三七愈伤组织RNA逆转录获得的cDNA第一链为模板扩增得到三七PnbHLH基因的ORF框。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测的结果如图2.2所示，在1000bp左右存在清晰的条带，条带大小与目的基因大小相符。根据胶回收试剂盒回收PCR产物，电泳检测回收条带正确；将回收的目的基因产物连接pMD18-T载体随后转化到大肠杆菌DH5α中，挑单克隆摇菌并编号，以菌液为模板、所设计的PnbHLH-F/R为引物进行菌液PCR阳性检测，图2.3所示2-7号菌液在大约1000bp处均有明亮的条带。选取编号为2、3及6号单克隆菌液送测序，将测序结果与本实验室先前序列进行比对，发现6号菌液序列相似性为99.74%，只有747bp处的一个碱基不同，表明所克隆的PnbHLH基因开放阅读框序列是正确的，大小为966bp。图2.2PnbHLH基因条带检测(1，2：PnbHLH基因；M：DNAMarkerDL2501)Fig.2.2PnbHLHfull-lengthproduct(1,2:PnbHLHgene;M:DNAMarkerDL2501)图2.3pMD18-T-PnbHLH大肠杆菌菌液PCR(M：DNAMarkerDL2501；1：阴性对照；2-7：菌液样品)Fig.2.3BacterialiquidPCRofpMD18-T-PnbHLHE.coli(M:DNAMarkerDL2501;1:Negativecontrol;2-7:Sampleofbacterialiquid)
【参考文献】：
期刊论文
[1]工业三七药渣中三七素的提取纯化及其止血药理活性研究[J]. 李双,杨晓涵,李怀宇,陈丽玲,刘艳红,王华晶,秦华炎,陈彤. 天然产物研究与开发. 2019(04)
[2]研究植物转基因技术的必要性探讨[J]. 高新梅,逯敏慧. 现代农业科技. 2019(04)
[3]MYC2转录因子参与植物发育调控的研究进展[J]. 李罡,李文龙,许雪梅,李成浩. 植物生理学报. 2019(02)
[4]花青素转录因子调控机制及代谢工程研究进展[J]. 宋雪薇,魏解冰,狄少康,庞永珍. 植物学报. 2019(01)
[5]植物甾醇降血脂作用的研究进展[J]. 薛延团,张晓凤,张得钧. 华西药学杂志. 2019(01)
[6]植物甾醇在养殖生产中的应用[J]. 黄志毅,孙凤刚,潘忠超,李威,郭世宁,熊鹰. 广东饲料. 2018(12)
[7]基于系统药理学分析三七总皂苷干预脑血管疾病的作用机制[J]. 聂娟,唐标. 湖南中医药大学学报. 2018(09)
[8]人参总皂苷提取工艺研究[J]. 王维坚,侯丽丽,陈洪海. 食品安全导刊. 2018(27)
[9]HPLC法测定三七中人参皂苷Rg1和三七皂苷R1的含量[J]. 李华丽,王小龙,李梅荣,叶晓亚. 海峡药学. 2018(05)
[10]三七“生打熟补”物质基础及药理作用研究进展[J]. 赵开华. 中医临床研究. 2018(13)
本文编号：3068274
【文章来源】：昆明理工大学云南省
【文章页数】：86 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
三七皂苷的生物合成途径（图中虚线表示多步酶促反应）
昆明理工大学硕士学位论文16筛选阳性单克隆菌液。将阳性菌液送生工生物公司测序，以获得正确的PnbHLH基因开放阅读框。2.3.4PnbHLH基因生物信息学分析DNAMAN软件用于进行DNA多重序列相似性比对；利用软件MEGA6.0构建Neighbor-joining系统进化树用于分析PnbHLH的系统发育多样性；PnbHLH基因编码蛋白的理化性质分析通过在线分析软件ExPASyBioinformaticsResourcePortal中的ProteomicsProtparam(http://www.expasy.ch/tools/protparam.html)完成；PnbHLH蛋白的二级结构通过软件PredictProtein(https://www.predictprotein.org/)进行预测，三维结构通过SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)进行预测。2.4结果与分析2.4.1三七细胞总RNA的提取和纯化通过完整的三七总RNA琼脂糖凝胶电泳检测发现，所提取的RNA条带均含有清晰的三条带，从上到下依次为28SrRNA、18SrRNA以及5SrRNA，且28SrRNA的条带亮度比18SrRNA条带亮(图2.1)；紫外分光光度计检测所提三七总RNA浓度发现A260/A280比值都在在1.8-2.0之间，这表明RNA中可能夹带蛋白等其他杂质，但浓度在该范围内仍旧可以用于后续实验的操作[49]；A260/A230比值均在2.08左右，说明所提取的三七总RNA质量较好，纯度较高。另外，水饱和酚有除蛋白的作用，氯仿可以有效去除蛋白和使有机相和水相分开，如果所提植物组织中存在蛋白等杂质含量较多的情况，可以在用苯酚氯仿抽提蛋白的步骤中适当重复一至两次进一步纯化RNA。图2.1三七总RNA琼脂糖凝胶电泳检测Fig.2.1AgarosegelelectrophoresisanalysisoftotalRNAofP.notoginseng
第二章三七PnbHLH转录因子基因的克隆与分析172.4.2克隆获得PnbHLH基因以上述所提三七愈伤组织RNA逆转录获得的cDNA第一链为模板扩增得到三七PnbHLH基因的ORF框。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测的结果如图2.2所示，在1000bp左右存在清晰的条带，条带大小与目的基因大小相符。根据胶回收试剂盒回收PCR产物，电泳检测回收条带正确；将回收的目的基因产物连接pMD18-T载体随后转化到大肠杆菌DH5α中，挑单克隆摇菌并编号，以菌液为模板、所设计的PnbHLH-F/R为引物进行菌液PCR阳性检测，图2.3所示2-7号菌液在大约1000bp处均有明亮的条带。选取编号为2、3及6号单克隆菌液送测序，将测序结果与本实验室先前序列进行比对，发现6号菌液序列相似性为99.74%，只有747bp处的一个碱基不同，表明所克隆的PnbHLH基因开放阅读框序列是正确的，大小为966bp。图2.2PnbHLH基因条带检测(1，2：PnbHLH基因；M：DNAMarkerDL2501)Fig.2.2PnbHLHfull-lengthproduct(1,2:PnbHLHgene;M:DNAMarkerDL2501)图2.3pMD18-T-PnbHLH大肠杆菌菌液PCR(M：DNAMarkerDL2501；1：阴性对照；2-7：菌液样品)Fig.2.3BacterialiquidPCRofpMD18-T-PnbHLHE.coli(M:DNAMarkerDL2501;1:Negativecontrol;2-7:Sampleofbacterialiquid)
【参考文献】：
期刊论文
[1]工业三七药渣中三七素的提取纯化及其止血药理活性研究[J]. 李双,杨晓涵,李怀宇,陈丽玲,刘艳红,王华晶,秦华炎,陈彤. 天然产物研究与开发. 2019(04)
[2]研究植物转基因技术的必要性探讨[J]. 高新梅,逯敏慧. 现代农业科技. 2019(04)
[3]MYC2转录因子参与植物发育调控的研究进展[J]. 李罡,李文龙,许雪梅,李成浩. 植物生理学报. 2019(02)
[4]花青素转录因子调控机制及代谢工程研究进展[J]. 宋雪薇,魏解冰,狄少康,庞永珍. 植物学报. 2019(01)
[5]植物甾醇降血脂作用的研究进展[J]. 薛延团,张晓凤,张得钧. 华西药学杂志. 2019(01)
[6]植物甾醇在养殖生产中的应用[J]. 黄志毅,孙凤刚,潘忠超,李威,郭世宁,熊鹰. 广东饲料. 2018(12)
[7]基于系统药理学分析三七总皂苷干预脑血管疾病的作用机制[J]. 聂娟,唐标. 湖南中医药大学学报. 2018(09)
[8]人参总皂苷提取工艺研究[J]. 王维坚,侯丽丽,陈洪海. 食品安全导刊. 2018(27)
[9]HPLC法测定三七中人参皂苷Rg1和三七皂苷R1的含量[J]. 李华丽,王小龙,李梅荣,叶晓亚. 海峡药学. 2018(05)
[10]三七“生打熟补”物质基础及药理作用研究进展[J]. 赵开华. 中医临床研究. 2018(13)
本文编号：3068274
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