棘孢木霉内切几丁质酶42基因表达调控与工程菌株构建
发布时间：2021-03-08 13:08
木霉属真菌在生物降解和生物防治方面有巨大的应用潜力,而其中棘孢木霉（Trichoderma asperellum）因生长迅速、抗生能力强、对农作物的生长有更全面地辅助作用等优点而被广泛应用于生物防治和降解方面。然而木霉菌的代谢产物产量较低,特异性强,抗生产物的调控机制研究不深等问题限制了木霉的应用,基于这种情况,本论文的主要目的是为了确定棘孢木霉T4的主要抗生蛋白之一,内切几丁质酶ech42基因的调控因子与几丁质酶诱导物质的转入方式,并采用基因工程和发酵工程的方法,提高棘孢木霉T4包括ech42蛋白在内的的几丁质酶产量,从而强化棘孢木霉抵抗病虫害的能力,进一步挖掘其作为生物防治菌的价值。在确定棘孢木霉T4（Trichoderma asperellum T4）有降解几丁质的能力之后,通过PCR获得ech42启动子区序列,用生物素Biotin对其进行标记之后将其与几丁质为唯一碳源的条件下生长的木霉T4的总蛋白反应获得特异性结合的蛋白;将这些蛋白收集并质谱测序后确定调控子蛋白为cdk5/pho85。利用RNA干扰和过表达的方法改变cdk5/pho85的基因表达量之后,结果显示相比较于野生型,...
【文章来源】：哈尔滨工业大学黑龙江省 211工程院校 985工程院校
【文章页数】：153 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
细菌内的ABC转运示意图
在微生物几丁质酶基因表达调控的研究上,仍然是细菌方面的研究相对最多。细菌的几丁质降解受多种蛋白控制,几丁质酶的分泌也受多种调控子调控,目前研究最多的有如下几类:总体调节因子、双组分调节系统、调节蛋白与启动子结合蛋白[39,40]。多效调节因子DasR在2002年就已经被报道是转录阻遏因子,该因子调控多种几丁质酶的表达。有文献利用计算机模拟以及体外实验证明DasR与PTS系统的多个基因有应答关系,且DasR在这些蛋白的启动子区都有结合位点,但磷酸葡糖胺能够解除抑制效应,有科学家因此认为磷酸葡糖胺是去阻遏功能的重要物质[141]。2007年,Saito等发现几丁寡糖调控dasR的转录,但几丁单糖却不能,因此许多科学家认为DasR是多功能调节因子,如同CRE1蛋白,不同之处在于DasR必须和转录蛋白结合之后才能影响几丁质酶表达[142]。最早ChiS/ChiR双组分调节系统是在1999年,热紫链霉菌中发现[143]。有研究将几丁质酶chi40、chis及chir三个基因转入浅青链霉菌中,发现酶活效果结果比单一转化chi40效果要高,很明显chis和chir对于几丁质酶chi40有刺激作用[144]:ChiS蛋白是感受胞外物质的感受器;而ChiR蛋白在胞内与DNA相互作用,从而调节后续表达。这两种蛋白构成的双组分系统调节下游几个几丁质酶的表达[145]。如图1-2所示:当胞外没有几丁寡糖时,DasA会与ChiS在细胞膜上结合,ChiS此时处于未激活状态,系统静止;当胞外有几丁寡糖时,寡糖与ChiS竞争性结合DasA,DasA不与ChiS结合时ChiS处于激活状态;ChiS将自身磷酸化之后将磷酸基团转移至ChiR并将其激活,激活的ChiR可以结合在几丁质基因的启动子上,启动几丁质酶基因的表达[146]。当chiR基因缺失后几丁质酶受几丁质诱导的程度显著降低,酶活力与野生型相比没有显著变化。这可能是由于双组分系统只能调节自身下游几丁质酶基因的表达,其它几丁质酶基因的表达不受影响,因此其他几丁质酶可能会增加表达量以弥补损失[147]。
研究技术路线
【参考文献】：
期刊论文
[1]木霉在植物病害生物防治中的应用及作用机制[J]. 尤佳琪,吴明德,李国庆. 中国生物防治学报. 2019(06)
[2]苏云金芽孢杆菌几丁质酶Chi73的特性及生物活性研究[J]. 刘佳,宋萍,张杰,南宫自艳,王勤英. 河北农业大学学报. 2019(04)
[3]木霉菌促生与拮抗作用研究进展[J]. 胡琼,刘茂泉. 农药. 2019(07)
[4]食用菌病原微生物生物防治研究进展[J]. 宋文俊,邓海平,石燕,刘贺贺,梁玖华. 绿色科技. 2019(12)
[5]产几丁质酶菌株的分离鉴定及产酶条件探究[J]. 左一萌,石晓玲,潘晓梅,王欢,尹永得,董雪滢,王超. 粮食科技与经济. 2019(05)
[6]生物防治在农业病虫害防治上的应用研究[J]. 曹建明. 种子科技. 2019(04)
[7]林业病虫害生物防治措施[J]. 吴有声. 现代农业科技. 2019(07)
[8]林业病虫害生物防治技术与管理措施[J]. 辛维丽. 吉林农业. 2019(05)
[9]抗棉铃虫Ⅳ型几丁质酶（HaCHT4）小鼠多克隆抗体的制备与鉴定[J]. 麦麦提艾力·阿卜杜纳斯尔,古新蓉,马纪,马小丽,刘小宁. 细胞与分子免疫学杂志. 2018(09)
[10]微生物几丁质酶研究进展及应用现状[J]. 刘朋,叶波平. 科学技术创新. 2018(12)
博士论文
[1]海洋细菌DL-6几丁质酶和几丁质结合蛋白的生化性质与功能研究[D]. 王晓辉.大连理工大学 2016
[2]飞蝗几丁质酶家族基因功能及RNAi介导的害虫防治应用研究[D]. 李大琪.山西大学 2016
[3]棘孢木霉和球毛壳菌免疫诱导蛋白及其功能研究[D]. 王允.哈尔滨工业大学 2013
硕士论文
[1]家蝇几丁质酶MDCht9的表达及功能研究[D]. 李妍.贵州医科大学 2019
[2]我国农田木霉菌多样性及生防研究[D]. 邱珊珊.浙江大学 2019
[3]飞蝗几丁质降解酶基因的异质性表达及酶学特性分析[D]. 李应龙.山西大学 2016
本文编号：3071097
【文章来源】：哈尔滨工业大学黑龙江省 211工程院校 985工程院校
【文章页数】：153 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
细菌内的ABC转运示意图
在微生物几丁质酶基因表达调控的研究上,仍然是细菌方面的研究相对最多。细菌的几丁质降解受多种蛋白控制,几丁质酶的分泌也受多种调控子调控,目前研究最多的有如下几类:总体调节因子、双组分调节系统、调节蛋白与启动子结合蛋白[39,40]。多效调节因子DasR在2002年就已经被报道是转录阻遏因子,该因子调控多种几丁质酶的表达。有文献利用计算机模拟以及体外实验证明DasR与PTS系统的多个基因有应答关系,且DasR在这些蛋白的启动子区都有结合位点,但磷酸葡糖胺能够解除抑制效应,有科学家因此认为磷酸葡糖胺是去阻遏功能的重要物质[141]。2007年,Saito等发现几丁寡糖调控dasR的转录,但几丁单糖却不能,因此许多科学家认为DasR是多功能调节因子,如同CRE1蛋白,不同之处在于DasR必须和转录蛋白结合之后才能影响几丁质酶表达[142]。最早ChiS/ChiR双组分调节系统是在1999年,热紫链霉菌中发现[143]。有研究将几丁质酶chi40、chis及chir三个基因转入浅青链霉菌中,发现酶活效果结果比单一转化chi40效果要高,很明显chis和chir对于几丁质酶chi40有刺激作用[144]:ChiS蛋白是感受胞外物质的感受器;而ChiR蛋白在胞内与DNA相互作用,从而调节后续表达。这两种蛋白构成的双组分系统调节下游几个几丁质酶的表达[145]。如图1-2所示:当胞外没有几丁寡糖时,DasA会与ChiS在细胞膜上结合,ChiS此时处于未激活状态,系统静止;当胞外有几丁寡糖时,寡糖与ChiS竞争性结合DasA,DasA不与ChiS结合时ChiS处于激活状态;ChiS将自身磷酸化之后将磷酸基团转移至ChiR并将其激活,激活的ChiR可以结合在几丁质基因的启动子上,启动几丁质酶基因的表达[146]。当chiR基因缺失后几丁质酶受几丁质诱导的程度显著降低,酶活力与野生型相比没有显著变化。这可能是由于双组分系统只能调节自身下游几丁质酶基因的表达,其它几丁质酶基因的表达不受影响,因此其他几丁质酶可能会增加表达量以弥补损失[147]。
研究技术路线
【参考文献】：
期刊论文
[1]木霉在植物病害生物防治中的应用及作用机制[J]. 尤佳琪,吴明德,李国庆. 中国生物防治学报. 2019(06)
[2]苏云金芽孢杆菌几丁质酶Chi73的特性及生物活性研究[J]. 刘佳,宋萍,张杰,南宫自艳,王勤英. 河北农业大学学报. 2019(04)
[3]木霉菌促生与拮抗作用研究进展[J]. 胡琼,刘茂泉. 农药. 2019(07)
[4]食用菌病原微生物生物防治研究进展[J]. 宋文俊,邓海平,石燕,刘贺贺,梁玖华. 绿色科技. 2019(12)
[5]产几丁质酶菌株的分离鉴定及产酶条件探究[J]. 左一萌,石晓玲,潘晓梅,王欢,尹永得,董雪滢,王超. 粮食科技与经济. 2019(05)
[6]生物防治在农业病虫害防治上的应用研究[J]. 曹建明. 种子科技. 2019(04)
[7]林业病虫害生物防治措施[J]. 吴有声. 现代农业科技. 2019(07)
[8]林业病虫害生物防治技术与管理措施[J]. 辛维丽. 吉林农业. 2019(05)
[9]抗棉铃虫Ⅳ型几丁质酶（HaCHT4）小鼠多克隆抗体的制备与鉴定[J]. 麦麦提艾力·阿卜杜纳斯尔,古新蓉,马纪,马小丽,刘小宁. 细胞与分子免疫学杂志. 2018(09)
[10]微生物几丁质酶研究进展及应用现状[J]. 刘朋,叶波平. 科学技术创新. 2018(12)
博士论文
[1]海洋细菌DL-6几丁质酶和几丁质结合蛋白的生化性质与功能研究[D]. 王晓辉.大连理工大学 2016
[2]飞蝗几丁质酶家族基因功能及RNAi介导的害虫防治应用研究[D]. 李大琪.山西大学 2016
[3]棘孢木霉和球毛壳菌免疫诱导蛋白及其功能研究[D]. 王允.哈尔滨工业大学 2013
硕士论文
[1]家蝇几丁质酶MDCht9的表达及功能研究[D]. 李妍.贵州医科大学 2019
[2]我国农田木霉菌多样性及生防研究[D]. 邱珊珊.浙江大学 2019
[3]飞蝗几丁质降解酶基因的异质性表达及酶学特性分析[D]. 李应龙.山西大学 2016
本文编号：3071097
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