产气肠杆菌B19 β-甘露聚糖酶基因的克隆表达及酶学性质研究
发布时间：2021-03-18 09:47
β-甘露聚糖酶（beta-mannanase）是一种水解类酶,能够随机切割线性甘露聚糖,半乳甘露聚糖,葡甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖等主链的β-1,4-D-甘露糖甘键。由于β-甘露聚糖酶降解甘露聚糖的价值和需求,来源于微生物的β-甘露聚糖酶的化学特性和结构性质,以及在各种应用被广泛而深入的研究。β-甘露聚糖酶可以应用在纸浆漂白、降低咖啡粘度、洗涤剂配方和食品和动物饲料等领域中。因此,对β-甘露聚糖酶进行异源表达,分离纯化以及酶学性质探究具有重要的研究意义。根据本实验室筛选产气肠杆菌B19菌株的16S rDNA,利用NCBI数据库中的BLAST功能在线比对16S rDNA,得到同源性较高的Enterobacter cloacae P101中的β-甘露聚糖酶基因序列,故以该菌株的β-甘露聚糖酶基因全长序列为模板,通过构建克隆载体,扩增并获得β-甘露聚糖酶的基因序列,将验证正确的β-甘露聚糖酶基因构建到pET28a（+）表达载体上,以大肠杆菌BL21（DE3）作为β-甘露聚糖酶异源表达的宿主菌,成功表达出β-甘露聚糖酶。通过Ni柱亲和层析法分离纯化得到纯度较高的β-甘露聚糖酶,该酶蛋白的分子大小...
【文章来源】：华南理工大学广东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：97 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
不同类型甘露聚糖的结构：(a)线性甘露聚糖；(b)葡甘露聚糖；(c)半乳甘露聚糖；(d)半乳葡甘露聚糖；甘露糖；葡萄糖；半乳糖
ies 团队根据糖苷水解酶的动力学数据和结构信息，发现糖苷键的水解是由两个接触残基实现的。通常一个是作为质子的供体酸性氨基酸和一个亲[6]，基于这些研究提出了一个通用的糖苷水解酶催化机制[7]。根据催化残不同，糖苷水解酶主要有两种催化机制：保留机制(Retaining MechanismsInverting Mechanisms)[8]。这两种催化机制都是通过处于催化活性位点上的酸或天冬氨酸）以酸碱催化方式进行催化的。来源的 β-甘露聚糖酶对不同底物的作用方式有所差别，β-甘露聚糖酶的具图 1-2。β-甘露聚糖酶在催化反应过程符合双替位机制，在反应过程中有基分别充当亲核催化位点和酸碱催化位点。一个谷氨酸作为亲核基团进攻原子，使糖苷键断裂形成共价中间体；另一个谷氨酸在催化过程中先进行质子稳定中间体，再进行碱催化，将水分子去质子化，最后完成水解过程糖酶催化机制如图 1-3。
图 1-3：β-甘露聚糖的催化反应原理（引自 Hilge[9]）Fig.1-3 Catalytic mechanism of beta-mannanase (quoted from Hilge[9])1.2.3 β-甘露聚糖酶的来源及性质β-甘露聚糖酶广泛的存在于动植物及微生物中，但目前进行商业化生产的 β糖酶大都来源于微生物，特别是细菌和真菌。微生物产生的 β-甘露聚糖酶具有种活性高、易分离纯化、稳定性好、温度和 pH 作用范围广和底物专一性强等显著特因此微生物来源的 β-甘露聚糖酶更易于广泛应用在工业生产和基础研究中。β-甘露聚糖酶由一个或多个亚基组成，酶蛋白的分子量之间存在很大的差异的 β-甘露聚糖酶包含了 1300 多个氨基酸残基，而最短的则只有 31 个氨基酸残生活环境和生存方式等方面不同的生物产生 β-甘露聚糖酶，在分子量、温度及 最适作用范围和稳定性、等电点、酶动力学常数、底物专一性等结构或性质上都大的差异。
【参考文献】：
期刊论文
[1]短小芽孢杆菌耐碱性β-甘露聚糖酶基因的异源表达及其酶学特性[J]. 唐嘉婕,郭苏,王伟,魏巍,魏东芝. 微生物学报. 2015(11)
[2]产β-甘露聚糖酶菌株的筛选鉴定及产酶条件的优化[J]. 杨苗,卢晓华,王常高,杜馨,林建国,蔡俊. 工业微生物. 2015(04)
[3]短小芽孢杆菌β-1,4-甘露聚糖酶的酶学性质及其在干酪乳杆菌中的表达[J]. 邹业霞,林金钟,卜雪梅,蒋露露,陈正军,葛向阳. 微生物学报. 2015(12)
[4]冬季添加β-甘露聚糖酶对白壳蛋鸡生产性能、蛋品质、血液指标的影响[J]. 张俊妍,华丽娜,郑传威,柴丽娜,刘伟,宁中华. 中国家禽. 2015(06)
[5]饲料级β-甘露聚糖酶对肉仔鸡生长性能的影响[J]. 梅宁安,白洁,丁建宁,陈桂芬. 甘肃畜牧兽医. 2014(02)
[6]日粮添加β-甘露聚糖酶对断奶仔猪生长性能和免疫功能的影响[J]. 乔家运,李海花,高欣,王文杰. 中国饲料. 2014(02)
[7]重组海栖热袍菌极耐热甘露聚糖酶的纯化和性质研究[J]. 张敏,江正强,李里特. 微生物学通报. 2008(10)
[8]辅酶Q10超声波破碎法提取工艺条件研究[J]. 李聚海,岳田利,袁亚宏. 西北农林科技大学学报(自然科学版). 2007(05)
[9]地衣芽孢杆菌β-甘露聚糖酶的基因克隆和鉴定[J]. 王正祥,马骏双,牛丹丹,石贵阳. 应用与环境生物学报. 2007(02)
[10]里氏木霉RUT-C30内切β-甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中的分泌表达[J]. 陈小兵,乔宇,丁宏标,岳明. 农业生物技术学报. 2007(01)
博士论文
[1]嗜热微生物来源的甘露聚糖酶的克隆表达、热稳定性及催化机理的研究[D]. 卢海强.中国农业科学院 2013
[2]甘露聚糖酶Man23的基因表达体系优化及其分子改造[D]. 周海燕.湖南农业大学 2008
硕士论文
[1]β-甘露聚糖酶发酵条件的优化、酶的纯化和性质研究[D]. 刘祖艳.东北林业大学 2014
[2]β-甘露聚糖酶产生菌株的分离鉴定、产酶条件优化及其酶学性质研究[D]. 靖德军.四川农业大学 2013
[3]CXJZ菌株分泌β-甘露聚糖酶的分离纯化及其酶学性质研究[D]. 李宝坤.新疆农业大学 2005
本文编号：3088131
【文章来源】：华南理工大学广东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：97 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
不同类型甘露聚糖的结构：(a)线性甘露聚糖；(b)葡甘露聚糖；(c)半乳甘露聚糖；(d)半乳葡甘露聚糖；甘露糖；葡萄糖；半乳糖
ies 团队根据糖苷水解酶的动力学数据和结构信息，发现糖苷键的水解是由两个接触残基实现的。通常一个是作为质子的供体酸性氨基酸和一个亲[6]，基于这些研究提出了一个通用的糖苷水解酶催化机制[7]。根据催化残不同，糖苷水解酶主要有两种催化机制：保留机制(Retaining MechanismsInverting Mechanisms)[8]。这两种催化机制都是通过处于催化活性位点上的酸或天冬氨酸）以酸碱催化方式进行催化的。来源的 β-甘露聚糖酶对不同底物的作用方式有所差别，β-甘露聚糖酶的具图 1-2。β-甘露聚糖酶在催化反应过程符合双替位机制，在反应过程中有基分别充当亲核催化位点和酸碱催化位点。一个谷氨酸作为亲核基团进攻原子，使糖苷键断裂形成共价中间体；另一个谷氨酸在催化过程中先进行质子稳定中间体，再进行碱催化，将水分子去质子化，最后完成水解过程糖酶催化机制如图 1-3。
图 1-3：β-甘露聚糖的催化反应原理（引自 Hilge[9]）Fig.1-3 Catalytic mechanism of beta-mannanase (quoted from Hilge[9])1.2.3 β-甘露聚糖酶的来源及性质β-甘露聚糖酶广泛的存在于动植物及微生物中，但目前进行商业化生产的 β糖酶大都来源于微生物，特别是细菌和真菌。微生物产生的 β-甘露聚糖酶具有种活性高、易分离纯化、稳定性好、温度和 pH 作用范围广和底物专一性强等显著特因此微生物来源的 β-甘露聚糖酶更易于广泛应用在工业生产和基础研究中。β-甘露聚糖酶由一个或多个亚基组成，酶蛋白的分子量之间存在很大的差异的 β-甘露聚糖酶包含了 1300 多个氨基酸残基，而最短的则只有 31 个氨基酸残生活环境和生存方式等方面不同的生物产生 β-甘露聚糖酶，在分子量、温度及 最适作用范围和稳定性、等电点、酶动力学常数、底物专一性等结构或性质上都大的差异。
【参考文献】：
期刊论文
[1]短小芽孢杆菌耐碱性β-甘露聚糖酶基因的异源表达及其酶学特性[J]. 唐嘉婕,郭苏,王伟,魏巍,魏东芝. 微生物学报. 2015(11)
[2]产β-甘露聚糖酶菌株的筛选鉴定及产酶条件的优化[J]. 杨苗,卢晓华,王常高,杜馨,林建国,蔡俊. 工业微生物. 2015(04)
[3]短小芽孢杆菌β-1,4-甘露聚糖酶的酶学性质及其在干酪乳杆菌中的表达[J]. 邹业霞,林金钟,卜雪梅,蒋露露,陈正军,葛向阳. 微生物学报. 2015(12)
[4]冬季添加β-甘露聚糖酶对白壳蛋鸡生产性能、蛋品质、血液指标的影响[J]. 张俊妍,华丽娜,郑传威,柴丽娜,刘伟,宁中华. 中国家禽. 2015(06)
[5]饲料级β-甘露聚糖酶对肉仔鸡生长性能的影响[J]. 梅宁安,白洁,丁建宁,陈桂芬. 甘肃畜牧兽医. 2014(02)
[6]日粮添加β-甘露聚糖酶对断奶仔猪生长性能和免疫功能的影响[J]. 乔家运,李海花,高欣,王文杰. 中国饲料. 2014(02)
[7]重组海栖热袍菌极耐热甘露聚糖酶的纯化和性质研究[J]. 张敏,江正强,李里特. 微生物学通报. 2008(10)
[8]辅酶Q10超声波破碎法提取工艺条件研究[J]. 李聚海,岳田利,袁亚宏. 西北农林科技大学学报(自然科学版). 2007(05)
[9]地衣芽孢杆菌β-甘露聚糖酶的基因克隆和鉴定[J]. 王正祥,马骏双,牛丹丹,石贵阳. 应用与环境生物学报. 2007(02)
[10]里氏木霉RUT-C30内切β-甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中的分泌表达[J]. 陈小兵,乔宇,丁宏标,岳明. 农业生物技术学报. 2007(01)
博士论文
[1]嗜热微生物来源的甘露聚糖酶的克隆表达、热稳定性及催化机理的研究[D]. 卢海强.中国农业科学院 2013
[2]甘露聚糖酶Man23的基因表达体系优化及其分子改造[D]. 周海燕.湖南农业大学 2008
硕士论文
[1]β-甘露聚糖酶发酵条件的优化、酶的纯化和性质研究[D]. 刘祖艳.东北林业大学 2014
[2]β-甘露聚糖酶产生菌株的分离鉴定、产酶条件优化及其酶学性质研究[D]. 靖德军.四川农业大学 2013
[3]CXJZ菌株分泌β-甘露聚糖酶的分离纯化及其酶学性质研究[D]. 李宝坤.新疆农业大学 2005
本文编号：3088131
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