稻瘟菌腺苷酸环化酶基因在疏棉状菌（Thermomyces Lanuginosus）中的功能分析
发布时间：2021-03-23 06:46
稻瘟病菌是水稻上最为重要的病害之一,它影响水稻产量和质量,每年都会造成严重的经济损失并威胁粮食安全,研究水稻稻瘟病的作用机制和相关功能有重要的科学价值和意义。腺苷酸环化酶相关蛋白是cAMP途径的关键酶类,它将ATP转化为cAMP,而cAMP是胞内第二信使,在信号传导方面十分关键。稻瘟菌中的腺苷酸环化酶（CAP）被报道参与菌丝生长,产孢,附着胞形成还调控体内cAMP水平。实验室前期研究发现十字花科炭疽菌中存在两段与稻瘟菌MoCAP蛋白结构相近的同源蛋白,将这两段十字花科基因分别回补至疏棉状菌CAP突变体时,能够不同程度的恢复其功能缺陷,发现两段基因分别调控不同功能,猜测MoCAP中存在两段不同功能的区段。借助疏棉状菌生长迅速,产孢高效,转化体系成熟的优势,我们希望通过将稻瘟菌MoCAP基因全段及分区段的回补至疏棉状菌中,研究不同功能区段的功能,同时研究MoCAP在疏棉状菌中的功能差异性。通过前期对疏棉状菌CAP敲除突变体的获得,进行了其自身基因的回补得到ΔCAP/CAP。通过与十字花科炭疽菌两段蛋白分析对比,将稻瘟菌CAP的氮端基因（氨基酸序列1-347,下称该片段为MoCAP-N）和碳...
【文章来源】：吉林大学吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：70 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
潮霉素敲除载体酶切位点结构图
第2章研究内容及方法295.最后将得到的L-pXEH-R载体质粒通过农杆菌转化，转化至农杆菌AGL-1中，并验证转化效果，无误后将得到的含有L-pXEH-R载体质粒的农杆菌菌株加入等体积50%无菌甘油保存在-80℃冰箱中。图2.2CAP敲除载体基于pXEH2.0的构建策略与原理Fig.2.2ConstructionstrategyandprincipleofCAPknockoutvectorbasedonpXEH2.02.2.6.2互补载体的构建互补载体以PKD-7定位载体为基础进行构建，通过随机插入的方法将互补的基因片段插入敲除突变体的基因组（图2.3）。将需要互补的片段连接至PKD-7互补定位载体之后，通过原生质体转化的方法，将载体导入疏棉状菌CAP敲除突变体中。前期研究中发现十字花科炭疽病菌中两个基因CH-07570和CH-14404分别于稻瘟病菌MoCAP基因的氨基酸序列氮端和碳端（相似度分别为45.72%和75.32%）。由此将稻瘟病菌MoCAP也分成两个部分，氮端片段MoCAP-N（氨基酸序列1-347）和碳端片段MoCAP-C（氨基酸序列374-531）拟利用4个互补基因片段，疏棉状菌全长CAP基因片段CAP；稻瘟病菌全长MoCAP基因片段MoCAP；疏稻瘟病菌MoCAP的氮端片段MoCAP-N和碳端片段MoCAP-C
第2章研究内容及方法30图2.3互补载体PKD-7结构视图Fig.2.3StructureviewofcomplementaryvectorPKD-71.互补载体的基因使用cDNA片段，首先需要培养疏棉状菌和稻瘟菌野生型菌株，提取RNA，并进行反转录得到相应cDNA。2.同时设计引物以扩增完整的基因片段，同时加上酶切位点，互补基因需要保证准确无误。以cDNA为模板扩增需要互补的四个片段CAP，MoCAP，MoCAP-N，MoCAP-C。将片段连接至PMD-18T载体后进行基因测序。测序结果对比原始基因序列，确保100%相符。3.无误后，即可对相应四个片段及PDK-7载体进行酶切，酶切位点按照设计好的片段位点，确保片段能与载体准确连接。酶切过后需要进行电泳和胶回收，回收酶切后的片段进行DNA连接反应。四个片段分别与酶切好的使用不同位点的PKD-7载体进行连接。得到4份不同的连接样品，进行大肠杆菌转化之后，验证确保连接无误。4.验证完毕连得到四个连接好的载体：PKD-7-CAP；PKD-7-MoCAP；PKD-7-MoCAP-N；PKD-7-MoCAP-C，载体构建之后需要培养载体菌株，提取菌株中含有的载体质粒备用。2.2.7疏棉状菌的农杆菌介导转化疏棉状菌的农杆菌介导转化在共培养期间使用未萌发的孢子，疏棉状菌孢子与根癌农杆菌在28℃下共培48h，AS浓度控制在500μM[26]。1.将含有敲除载体的AGL-1菌株从-80℃冰箱中取出解冻，在50μg/ml利福平和卡那霉素抗性的LB培养基中培养约2天直至菌液浑浊。2.接种疏棉状菌至PDA固体培养基中，50℃培养5天至平板长满菌丝，之后置于37℃下诱导产包7天，以备使用。3.准备完毕后开始转化实验，配制混合IM诱导培养基（见表2.6）20ml
【参考文献】：
期刊论文
[1]农杆菌介导的获取疏绵状嗜热丝孢菌插入突变体体系的建立(英文)[J]. 韩华,徐晓雪,彭延杰,孔德慧,李多川. 微生物学报. 2012(12)
[2]疏绵状嗜热丝孢菌原生质体的制备与再生[J]. 周庆新,陈静,于恺,李多川. 菌物研究. 2006(02)
[3]Promoter trapping in Magnaporthe grisea[J]. 刘小红,卢建平,王教瑜,闵航,林福呈. Journal of Zhejiang University Science. 2006(01)
[4]REMI及其相关技术在丝状真菌基因克隆中的应用[J]. 莫明和,徐进,张克勤. 生物技术. 2004(01)
本文编号：3095351
【文章来源】：吉林大学吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：70 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
潮霉素敲除载体酶切位点结构图
第2章研究内容及方法295.最后将得到的L-pXEH-R载体质粒通过农杆菌转化，转化至农杆菌AGL-1中，并验证转化效果，无误后将得到的含有L-pXEH-R载体质粒的农杆菌菌株加入等体积50%无菌甘油保存在-80℃冰箱中。图2.2CAP敲除载体基于pXEH2.0的构建策略与原理Fig.2.2ConstructionstrategyandprincipleofCAPknockoutvectorbasedonpXEH2.02.2.6.2互补载体的构建互补载体以PKD-7定位载体为基础进行构建，通过随机插入的方法将互补的基因片段插入敲除突变体的基因组（图2.3）。将需要互补的片段连接至PKD-7互补定位载体之后，通过原生质体转化的方法，将载体导入疏棉状菌CAP敲除突变体中。前期研究中发现十字花科炭疽病菌中两个基因CH-07570和CH-14404分别于稻瘟病菌MoCAP基因的氨基酸序列氮端和碳端（相似度分别为45.72%和75.32%）。由此将稻瘟病菌MoCAP也分成两个部分，氮端片段MoCAP-N（氨基酸序列1-347）和碳端片段MoCAP-C（氨基酸序列374-531）拟利用4个互补基因片段，疏棉状菌全长CAP基因片段CAP；稻瘟病菌全长MoCAP基因片段MoCAP；疏稻瘟病菌MoCAP的氮端片段MoCAP-N和碳端片段MoCAP-C
第2章研究内容及方法30图2.3互补载体PKD-7结构视图Fig.2.3StructureviewofcomplementaryvectorPKD-71.互补载体的基因使用cDNA片段，首先需要培养疏棉状菌和稻瘟菌野生型菌株，提取RNA，并进行反转录得到相应cDNA。2.同时设计引物以扩增完整的基因片段，同时加上酶切位点，互补基因需要保证准确无误。以cDNA为模板扩增需要互补的四个片段CAP，MoCAP，MoCAP-N，MoCAP-C。将片段连接至PMD-18T载体后进行基因测序。测序结果对比原始基因序列，确保100%相符。3.无误后，即可对相应四个片段及PDK-7载体进行酶切，酶切位点按照设计好的片段位点，确保片段能与载体准确连接。酶切过后需要进行电泳和胶回收，回收酶切后的片段进行DNA连接反应。四个片段分别与酶切好的使用不同位点的PKD-7载体进行连接。得到4份不同的连接样品，进行大肠杆菌转化之后，验证确保连接无误。4.验证完毕连得到四个连接好的载体：PKD-7-CAP；PKD-7-MoCAP；PKD-7-MoCAP-N；PKD-7-MoCAP-C，载体构建之后需要培养载体菌株，提取菌株中含有的载体质粒备用。2.2.7疏棉状菌的农杆菌介导转化疏棉状菌的农杆菌介导转化在共培养期间使用未萌发的孢子，疏棉状菌孢子与根癌农杆菌在28℃下共培48h，AS浓度控制在500μM[26]。1.将含有敲除载体的AGL-1菌株从-80℃冰箱中取出解冻，在50μg/ml利福平和卡那霉素抗性的LB培养基中培养约2天直至菌液浑浊。2.接种疏棉状菌至PDA固体培养基中，50℃培养5天至平板长满菌丝，之后置于37℃下诱导产包7天，以备使用。3.准备完毕后开始转化实验，配制混合IM诱导培养基（见表2.6）20ml
【参考文献】：
期刊论文
[1]农杆菌介导的获取疏绵状嗜热丝孢菌插入突变体体系的建立(英文)[J]. 韩华,徐晓雪,彭延杰,孔德慧,李多川. 微生物学报. 2012(12)
[2]疏绵状嗜热丝孢菌原生质体的制备与再生[J]. 周庆新,陈静,于恺,李多川. 菌物研究. 2006(02)
[3]Promoter trapping in Magnaporthe grisea[J]. 刘小红,卢建平,王教瑜,闵航,林福呈. Journal of Zhejiang University Science. 2006(01)
[4]REMI及其相关技术在丝状真菌基因克隆中的应用[J]. 莫明和,徐进,张克勤. 生物技术. 2004(01)
本文编号：3095351
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