大丽轮枝菌乙酰乳酸合成酶基因VdILV2和VdILV6的克隆及功能研究
发布时间：2021-03-25 05:27
棉花黄萎病是一种土传的维管束真菌病害,被称为棉花的“癌症”,其致病菌为大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）。V.dahliae致病机理十分复杂且其微菌核在土壤中存活时间久,至今仍无有效的防治方法。研究V.dahliae致病过程中重要基因的功能,有助于进一步揭示V.dahliae致病分子机制,对于棉花黄萎病的防治具有重要的指导意义。寄主诱导的基因沉默（host-induced gene silencing,HIGS）是一种通过沉默病原菌毒力基因来防治作物病害或进行基因功能验证的实用有效技术。本研究利用HIGS技术,以V.dahliae乙酰乳酸合成酶（VdALS）基因为靶标构建了一系列烟草脆裂病毒（tobacco rattle virus,TRV）干扰载体,对VdILV2和VdILV6的毒力功能进行分析鉴定。并构建VdILV2基因敲除载体,进行了基因敲除突变株的筛选,以进一步解析该基因在生长发育过程中的功能。主要研究结果如下:1、通过与稻瘟病菌中乙酰乳酸合成酶（ALS）同源比对,克隆了V.dahliae中ALS催化亚基和调节亚基,分别命名为VdILV2和VdILV6;生物...
【文章来源】：河南科技学院河南省
【文章页数】：78 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图1-1支链氨基酸生物合成途径Fig.1-1Biosynthesispathwayofthebranched-chainaminoacid
大丽轮枝菌乙酰乳酸合成酶基因VdILV2和VdILV6的克隆及功能研究10剂的作用机制有了更深入的了解；为应对杂草的抗药性，研发设计全新类型的靶向ALS的绿色新型除草剂，仍是一个重要并亟待解决的科学问题；同时，ALS作为抗菌药物的靶标值得更深入研究。图1-2ALS及其抑制剂作用机理[92]Fig.1-2MechanismofALSanditsinhibitors1.4.4ALS在病原真菌中的研究进展与细菌和植物相比，对真菌ALS的研究相对较少。1972年，Glatzer首次从N.crassa中分离出真菌ALS，不同物种之间ALS基因的拷贝数存在差异，有的是单拷贝，有的是多拷贝，真菌中不包含同工酶，只编码一个ALS（核编码的蛋白，定位于线粒体）[93]。1985年，Falco等在酵母（Saccharomycescerevisiae）中发现并克隆了ALS，在酵母中只存在1个具有功能的ALS基因[94]，后来以酵母的ALS基因为基础筛选到了拟南芥中ALS基因，为人们发掘植物体内ALS基因提供了方便[95]；酵母ALS是核内编码，定位于线粒体，催化亚基由ILV2编码，调节亚基由ILV6编码；ILV6蛋白可将ILV2蛋白的催化
大丽轮枝菌乙酰乳酸合成酶基因VdILV2和VdILV6的克隆及功能研究12或侵染的病原真菌(B10)转录产物的沉默（图1-3）。HIGS通常以病原菌生长、发育、侵染或者致病力所必需的基因为靶标，真菌的一些必需基因具有保守性，只在它们的基因组中存在，这使得真菌的RNAi更具有可行性。通过构建靶向病原菌特定基因的RNAi载体，在寄主植物内表达RNA干扰分子，特异沉默病原菌靶标基因，限制了病原菌生长、发育和侵染性，使寄主植株获得对病原菌的抗性，该方法不仅可以抵御病毒入侵，在抗细菌、真菌及害虫防治中也有良好的效果。图1-3HIGS沉默机制[105]Figure1-3SilencingmechanismofHIGS1.5.2跨界RNA转移机制在植物-病原体互作中，Weiberg[106]发现灰霉病菌（Botrytiscinerea）可以输出sRNAs到寄主植物中沉默寄主植物的免疫防卫基因。在随后的研究中，在拟南芥（A.thaliana）和西红柿中表达靶向B.cinereaDCL基因的转录本，结果降低了灰霉菌的生长和致病性，使寄主植物获得了对B.cinerea的抗性[107]。但是人们并不清楚寄主产生的小RNA是如何转移到病原菌中的，Nowara等（2010）提出分泌的siRNA或dsRNA可能是经过exosomal途径从小麦或大麦到白粉病菌并引起白粉病菌靶基因的沉默，然而，RNA是如何从植物的细胞核穿过细胞膜和细胞壁进入到真菌细胞中的还有待进一步确定。最近的研究证实，A.thaliana是通过分泌类外泌体囊泡（exosome-likeextracellularvesicles）来传送寄主产生的sRNAs到B.cinerea中的，这些含有sRNA的囊泡在感染部位累积并被真菌细胞吸收（图1-4），该研究为HIGS技术的应用提供了理论依据，为进一步揭示跨界RNA转移机制奠定了重要基础[108]。
本文编号：3099117
【文章来源】：河南科技学院河南省
【文章页数】：78 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图1-1支链氨基酸生物合成途径Fig.1-1Biosynthesispathwayofthebranched-chainaminoacid
大丽轮枝菌乙酰乳酸合成酶基因VdILV2和VdILV6的克隆及功能研究10剂的作用机制有了更深入的了解；为应对杂草的抗药性，研发设计全新类型的靶向ALS的绿色新型除草剂，仍是一个重要并亟待解决的科学问题；同时，ALS作为抗菌药物的靶标值得更深入研究。图1-2ALS及其抑制剂作用机理[92]Fig.1-2MechanismofALSanditsinhibitors1.4.4ALS在病原真菌中的研究进展与细菌和植物相比，对真菌ALS的研究相对较少。1972年，Glatzer首次从N.crassa中分离出真菌ALS，不同物种之间ALS基因的拷贝数存在差异，有的是单拷贝，有的是多拷贝，真菌中不包含同工酶，只编码一个ALS（核编码的蛋白，定位于线粒体）[93]。1985年，Falco等在酵母（Saccharomycescerevisiae）中发现并克隆了ALS，在酵母中只存在1个具有功能的ALS基因[94]，后来以酵母的ALS基因为基础筛选到了拟南芥中ALS基因，为人们发掘植物体内ALS基因提供了方便[95]；酵母ALS是核内编码，定位于线粒体，催化亚基由ILV2编码，调节亚基由ILV6编码；ILV6蛋白可将ILV2蛋白的催化
大丽轮枝菌乙酰乳酸合成酶基因VdILV2和VdILV6的克隆及功能研究12或侵染的病原真菌(B10)转录产物的沉默（图1-3）。HIGS通常以病原菌生长、发育、侵染或者致病力所必需的基因为靶标，真菌的一些必需基因具有保守性，只在它们的基因组中存在，这使得真菌的RNAi更具有可行性。通过构建靶向病原菌特定基因的RNAi载体，在寄主植物内表达RNA干扰分子，特异沉默病原菌靶标基因，限制了病原菌生长、发育和侵染性，使寄主植株获得对病原菌的抗性，该方法不仅可以抵御病毒入侵，在抗细菌、真菌及害虫防治中也有良好的效果。图1-3HIGS沉默机制[105]Figure1-3SilencingmechanismofHIGS1.5.2跨界RNA转移机制在植物-病原体互作中，Weiberg[106]发现灰霉病菌（Botrytiscinerea）可以输出sRNAs到寄主植物中沉默寄主植物的免疫防卫基因。在随后的研究中，在拟南芥（A.thaliana）和西红柿中表达靶向B.cinereaDCL基因的转录本，结果降低了灰霉菌的生长和致病性，使寄主植物获得了对B.cinerea的抗性[107]。但是人们并不清楚寄主产生的小RNA是如何转移到病原菌中的，Nowara等（2010）提出分泌的siRNA或dsRNA可能是经过exosomal途径从小麦或大麦到白粉病菌并引起白粉病菌靶基因的沉默，然而，RNA是如何从植物的细胞核穿过细胞膜和细胞壁进入到真菌细胞中的还有待进一步确定。最近的研究证实，A.thaliana是通过分泌类外泌体囊泡（exosome-likeextracellularvesicles）来传送寄主产生的sRNAs到B.cinerea中的，这些含有sRNA的囊泡在感染部位累积并被真菌细胞吸收（图1-4），该研究为HIGS技术的应用提供了理论依据，为进一步揭示跨界RNA转移机制奠定了重要基础[108]。
本文编号：3099117
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