利用运动发酵单孢菌基因元件构建产β-胡萝卜素大肠杆菌工程菌株
发布时间：2021-03-26 09:23
β-胡萝卜素是天然的着色剂和营养增强剂,在食品行业受到广泛应用。目前,通过代谢工程菌株有望提高β-胡萝卜素的产量,从而替代天然提取或化学合成方法。由于β-胡萝卜素的生物合成涉及多个基因,构建高效合成代谢途径成为获得高产β-胡萝卜素工程菌株的关键。本论文利用合成生物学和代谢工程手段构建产β-胡萝卜素大肠杆菌工程菌株,并联合理性改造、随机诱变和发酵优化技术建立了提高β-胡萝卜素产量的可行策略。主要研究内容及结果如下:1.β-胡萝卜素合成代谢途径组装及工程菌株构建。首先,分析运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）ZM4菌株的启动子元件活性,筛选出代表性的启动子和终止子元件分别构建元件库。其次,利用Golden Gate技术将来自成团泛菌（Pantoea agglomerans）CGMCC 1.2244的β-胡萝卜素合成基因簇与元件库进行随机组装并获得43株工程菌,其中Crt1-29的β-胡萝卜素产量最高为0.68 mg/g细胞干重（DCW）。2.理性设计优化β-胡萝卜素合成代谢。为进一步优化β-胡萝卜素生物合成途径,将β-胡萝卜素合成基因簇分为crtE、crtXYI和crtB三...
【文章来源】：成都大学四川省
【文章页数】：90 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
β-胡萝卜素生物合成途径
成都大学硕士学位论文9图1.2BsmBⅠ、BbsⅠ限制性内切酶识别位点Fig.1.2TherecognitionsiteofrestrictionendonucleasesBsmBⅠandBbsⅠ同样基于核酸外切酶发展的Gibson组装技术[88]也可在体外实现多个末端具有重叠序列的DNA片段组装，反应时间只需15-60min，但是组装效率和准确率会随着组装片段增加而降低。SLIC技术则是利用T4DNA聚合酶发挥的外切活性将DNA消化产生重叠序列，经过退火实现组装，是构建生物合成途径的有效方法，但该技术组装的片段不能过大。DNA元件组装技术是合成生物学的重要工具，除文中提到的技术外，其他许多DNA组装技术也快速的发展起来，为高效和快速地实现大片段组装以及多元件库优化等提供了可能。表1.2不同DNA组装技术特点Tab.1.2ThecharacteristicsofdifferentDNAassemblytechnologies技术名称优点缺点OE-PCR高效、无痕对DNA聚合酶高保真度有依赖性，组装片段不能过大BioBrick可进行多片段组装存在DNA残痕，对DNA序列有依赖性GoldenGate高效、无痕，可一次实现多个片段的组装对DNA序列有依赖性GibsonAssembly无痕且可进行大片段组装效率和正确率会随着组装片段增加而降低，存在重复片段时难以组装SLIC高效、无痕片段不能过大TAR高效能实现整个基因组的组装片段过大或存在重复序列时会发生片段断裂缺失1.4诱变育种微生物在食品、医药和环境等领域一直发挥着重要作用，而野生菌株因其不良特性（如产量低、耐受性差、副产物等）的影响往往无法满足市场的需求。为获得高产、性能优良的菌株，对微生物进行诱变处理成为改善微生物的有力工具。诱变育种具有操作简便和突变谱广的特点，并且不需要了解菌株的遗传背景，适用于多种工业微生物的育
成都大学硕士学位论文111.5论文设计1.5.1研究目的与意义本研究旨在结合合成生物学、代谢工程技术、诱变筛选和发酵工程技术，通过理性设计结合随机诱变和发酵优化，建立一套高效的多基因代谢途径组装、筛选和优化技术方法，实现生物基化学品产量的提升。本研究也为运动发酵单胞菌内源性生物元件的评估和应用、建立多基因代谢途径的高效组装，以及代谢工程体系优化过程提供了参考。1.5.2研究内容本文通过GoldenGate先进技术进行了β-胡萝卜素合成途径的组装和优化，获得产β-胡萝卜素大肠杆菌工程菌株，并通过常压室温等离子体诱变筛选和发酵参数优化逐步提高了菌株的β-胡萝卜素产量。主要研究内容如下：①β-胡萝卜素合成代谢途径组装及工程菌株构建②产β-胡萝卜素工程菌株诱变筛选③产β-胡萝卜素工程菌株发酵1.5.3技术路线图1.3技术路线Fig.1.3Technicalrouteofthisthesis
【参考文献】：
期刊论文
[1]利用常压室温等离子体诱变选育三孢布拉氏霉菌类胡萝卜素产量差异菌株[J]. 谢录翰,康春婷,孙菊鲜,侯婕,葛欣. 江苏农业科学. 2019(24)
[2]硫模块启动子对提高L-甲硫氨酸的生物合成的影响及发酵培养条件的优化[J]. 金利群,金伟熔,柳志强. 食品与发酵工业. 2019(19)
[3]符合工程化需求的生物元件设计[J]. 崔颖璐,吴边. 中国科学院院刊. 2018(11)
[4]MEP代谢通路组合优化提高β-胡萝卜素产量（英文）[J]. 刘乐山,刘海元,谢丽萍,胡又佳. 中国医药工业杂志. 2018(07)
[5]细胞膜合成途径模块化调控与形态改造提高大肠杆菌β-胡萝卜素的积累与产量[J]. 武陶,张柏林,毕昌昊. 生物工程学报. 2018(05)
[6]通过番茄红素环化酶的优化构建β-胡萝卜素高产菌株[J]. 金应福,韩莉,张莎莎,李世忠,刘伟丰,陶勇. 生物工程学报. 2017(11)
[7]高通量筛选诱变菌株降低黄酒发酵氨基甲酸乙酯前体积累[J]. 程艳,堵国成,周景文,陈坚. 微生物学报. 2017(10)
[8]启动子研究进展[J]. 李法君. 生物学教学. 2017(07)
[9]解淀粉芽孢杆菌诱变育种及其突变株在降低酱油中氨基甲酸乙酯的应用[J]. 张梦寒,李巧玉,周朝晖,卢丽玲,堵国成,陈坚,方芳. 微生物学报. 2017(12)
[10]启动子的类型及应用[J]. 贺飞燕,闫建俊,白云凤,冯瑞云,施俊凤. 山西农业科学. 2017(01)
硕士论文
[1]重离子诱变技术选育高产β-葡聚糖酵母菌株的研究[D]. 李垄清.中国科学院大学(中国科学院近代物理研究所) 2017
[2]产番茄红素大肠杆菌的构建和发酵条件优化[D]. 孙涛.天津科技大学 2014
[3]β-胡萝卜素的化学合成及其性质研究[D]. 汤丹丹.江南大学 2011
本文编号：3101365
【文章来源】：成都大学四川省
【文章页数】：90 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
β-胡萝卜素生物合成途径
成都大学硕士学位论文9图1.2BsmBⅠ、BbsⅠ限制性内切酶识别位点Fig.1.2TherecognitionsiteofrestrictionendonucleasesBsmBⅠandBbsⅠ同样基于核酸外切酶发展的Gibson组装技术[88]也可在体外实现多个末端具有重叠序列的DNA片段组装，反应时间只需15-60min，但是组装效率和准确率会随着组装片段增加而降低。SLIC技术则是利用T4DNA聚合酶发挥的外切活性将DNA消化产生重叠序列，经过退火实现组装，是构建生物合成途径的有效方法，但该技术组装的片段不能过大。DNA元件组装技术是合成生物学的重要工具，除文中提到的技术外，其他许多DNA组装技术也快速的发展起来，为高效和快速地实现大片段组装以及多元件库优化等提供了可能。表1.2不同DNA组装技术特点Tab.1.2ThecharacteristicsofdifferentDNAassemblytechnologies技术名称优点缺点OE-PCR高效、无痕对DNA聚合酶高保真度有依赖性，组装片段不能过大BioBrick可进行多片段组装存在DNA残痕，对DNA序列有依赖性GoldenGate高效、无痕，可一次实现多个片段的组装对DNA序列有依赖性GibsonAssembly无痕且可进行大片段组装效率和正确率会随着组装片段增加而降低，存在重复片段时难以组装SLIC高效、无痕片段不能过大TAR高效能实现整个基因组的组装片段过大或存在重复序列时会发生片段断裂缺失1.4诱变育种微生物在食品、医药和环境等领域一直发挥着重要作用，而野生菌株因其不良特性（如产量低、耐受性差、副产物等）的影响往往无法满足市场的需求。为获得高产、性能优良的菌株，对微生物进行诱变处理成为改善微生物的有力工具。诱变育种具有操作简便和突变谱广的特点，并且不需要了解菌株的遗传背景，适用于多种工业微生物的育
成都大学硕士学位论文111.5论文设计1.5.1研究目的与意义本研究旨在结合合成生物学、代谢工程技术、诱变筛选和发酵工程技术，通过理性设计结合随机诱变和发酵优化，建立一套高效的多基因代谢途径组装、筛选和优化技术方法，实现生物基化学品产量的提升。本研究也为运动发酵单胞菌内源性生物元件的评估和应用、建立多基因代谢途径的高效组装，以及代谢工程体系优化过程提供了参考。1.5.2研究内容本文通过GoldenGate先进技术进行了β-胡萝卜素合成途径的组装和优化，获得产β-胡萝卜素大肠杆菌工程菌株，并通过常压室温等离子体诱变筛选和发酵参数优化逐步提高了菌株的β-胡萝卜素产量。主要研究内容如下：①β-胡萝卜素合成代谢途径组装及工程菌株构建②产β-胡萝卜素工程菌株诱变筛选③产β-胡萝卜素工程菌株发酵1.5.3技术路线图1.3技术路线Fig.1.3Technicalrouteofthisthesis
【参考文献】：
期刊论文
[1]利用常压室温等离子体诱变选育三孢布拉氏霉菌类胡萝卜素产量差异菌株[J]. 谢录翰,康春婷,孙菊鲜,侯婕,葛欣. 江苏农业科学. 2019(24)
[2]硫模块启动子对提高L-甲硫氨酸的生物合成的影响及发酵培养条件的优化[J]. 金利群,金伟熔,柳志强. 食品与发酵工业. 2019(19)
[3]符合工程化需求的生物元件设计[J]. 崔颖璐,吴边. 中国科学院院刊. 2018(11)
[4]MEP代谢通路组合优化提高β-胡萝卜素产量（英文）[J]. 刘乐山,刘海元,谢丽萍,胡又佳. 中国医药工业杂志. 2018(07)
[5]细胞膜合成途径模块化调控与形态改造提高大肠杆菌β-胡萝卜素的积累与产量[J]. 武陶,张柏林,毕昌昊. 生物工程学报. 2018(05)
[6]通过番茄红素环化酶的优化构建β-胡萝卜素高产菌株[J]. 金应福,韩莉,张莎莎,李世忠,刘伟丰,陶勇. 生物工程学报. 2017(11)
[7]高通量筛选诱变菌株降低黄酒发酵氨基甲酸乙酯前体积累[J]. 程艳,堵国成,周景文,陈坚. 微生物学报. 2017(10)
[8]启动子研究进展[J]. 李法君. 生物学教学. 2017(07)
[9]解淀粉芽孢杆菌诱变育种及其突变株在降低酱油中氨基甲酸乙酯的应用[J]. 张梦寒,李巧玉,周朝晖,卢丽玲,堵国成,陈坚,方芳. 微生物学报. 2017(12)
[10]启动子的类型及应用[J]. 贺飞燕,闫建俊,白云凤,冯瑞云,施俊凤. 山西农业科学. 2017(01)
硕士论文
[1]重离子诱变技术选育高产β-葡聚糖酵母菌株的研究[D]. 李垄清.中国科学院大学(中国科学院近代物理研究所) 2017
[2]产番茄红素大肠杆菌的构建和发酵条件优化[D]. 孙涛.天津科技大学 2014
[3]β-胡萝卜素的化学合成及其性质研究[D]. 汤丹丹.江南大学 2011
本文编号：3101365
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