应用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立差异甲基化区CGI-2敲除小鼠
发布时间：2021-03-27 19:57
Dlk1-Dio3印记区是小鼠基因组中一个重要的印记基因簇,存在多个蛋白编码基因、长非编码RNA基因,以及为数众多的micro RNA和sno RNA基因。此印记区间基因的印记表达对于胚胎发育十分重要。深入研究此印记区基因的表达调控及作用机制,对于揭示印记基因在胚胎发育中的作用及获取高质量i PS细胞具有重要意义。而目前的研究仅限于三个已知的父本甲基化的差异甲基化区（IG-DMR,Gtl2-DMR和Dlk1-DMR）对该印记区的基因表达调控。因此,寻找和鉴定新的差异甲基化区对进一步解析此印记区的基因调控机制及分子机理具有重要意义。结合本实验室前期研究发现的一个新的差异甲基化区CGI-2,本课题利用新一代基因编辑技术CRISPR/Cas9,建立差异甲基化区CGI-2敲除小鼠。我们首先设计并制备了用于sg RNA体外转录的模板和Cas9体外转录模板,然后通过显微注射方式注射到小鼠受精卵中,并将其培养至囊胚,然后移植到假孕母鼠子宫内,成功获得了一只Founder（首建小鼠）。最终移植了64枚囊胚,获得5只新生小鼠,经鉴定,有1只CGI-2单等位敲除的小鼠,总阳性率为20%。我们将Founde...
【文章来源】：哈尔滨工业大学黑龙江省 211工程院校 985工程院校
【文章页数】：67 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
小鼠Dlk1-Dio3印记区域结构示意图
图 1-2 CGI-2 差异甲基化区的位置CRISPR/Cas9 是最近发现的一种新型基因组定点编辑技术。CRISPR 是一规则和短隔行重复序列。它是在大肠杆菌编码的碱性磷酸酶基因的研究中[10]。它最初存在于含有多个短重复序列的细菌和古细菌的基因组中。它己提供特定的免疫保护机制。入侵外来的元素，如病毒和质粒[11]。CRISP要依靠 crRNA（CRISPR RNA）和 tracrRNA（反式激活嵌合 RNA）组合Cas 蛋白进行外源 DNA 序列特异性降解[12]。在此基础上，可以在基因组的进行基因打靶，基因插入和基因修复的基因操作。这种新的基因组定点比类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)和锌指核酸酶(ZFN)技术具有构单快捷、突变效率高、成本低廉、适用范围广等许多优点，已成为一种因组编辑工具。该技术已成功应用于细菌、人类细胞、斑马鱼、小鼠、猴以及多种植物的基因组精确修饰，是最具有临床与应用前景的基因治一。所以本课题拟通过利用新一代基因编辑技术 CRISPR/Cas9，建立差区 CGI-2 敲除小鼠并对相关基因印记表达的影响，本研究结果对进一步
图 1-3 CRISPR/Cas9 原理示意图CRISPR/Cas 系统的功能可以分为三个阶段。第一阶段是获得一个新的间隔二阶段是 CRISPR 基因座的表达，包括转录和转录后处理，第三阶段是干扰源基因物质的 CRISPR/Cas 系统。在开始下一段之前，我们首先解释两个名原始间隔序列（原型间隔区），它是一个间隔序列或质粒序列，与间隔序列。PAM 是原型间隔区 5'或 3'末端的保守序列，其长度一般为 2-5bp，接近原区[57]。在不同的菌株或不同类型的 CRISPR/Cas 系统中，PAM 序列和位置的。例如在酿脓链球菌中，PAM 序列是 NGG，N 可以是任何核苷酸，没有差位于原型间隔子的 3'末端[58,59]，而在嗜热链球菌（嗜热链球菌）中，I 型 PA是 AGAAA/ T，其位于 3 '原型间隔的末端[60,61]，II 型的 PAM 序列是 GGNG在原型间隔的 3'末端，在 5'末端。在硫化叶菌中 PAM 序列是 TCC[62]。值得是部分 III 型 CRISPR/Cas 系统的原型间隔器中没有 PAM 序列。.3.2 CRISPR/Cas9 的国内外研究现状
【参考文献】：
期刊论文
[1]CRISPR/Cas9技术研究进展[J]. 李和刚,杨峰,张宝珣,李培培,王建华,包汉勋,苗刚,江科,柳楠. 中国畜牧杂志. 2015(21)
[2]CRISPR/Cas技术研究进展[J]. 常振仪,严维,刘东风,陈竹锋,谢刚,卢嘉威,吴建新,唐晓艳. 农业生物技术学报. 2015(09)
[3]CRISPR/Cas:新一代基因编辑技术[J]. 黄妤,王世春. 生命的化学. 2015(01)
[4]CRISPR/Cas9系统介导基因组编辑的研究进展[J]. 刘志国. 畜牧兽医学报. 2014(10)
[5]外源基因在转基因动物中遗传和表达的稳定性[J]. 孔庆然,刘忠华. 遗传. 2011(05)
[6]DNA甲基化研究进展[J]. 王琦,胡凤成,李春明. 科技情报开发与经济. 2009(29)
[7]转基因技术在动物遗传改良上的应用进展[J]. 刘中华,王华岩,乔宪凤,郑新民. 湖北农业科学. 2009(02)
[8]哺乳动物转基因技术研究概况[J]. 孙剑锋,岳文斌. 山西农业科学. 2008(01)
[9]转基因技术改良家畜的现状与趋势[J]. 童佳,李宁. 中国农业科技导报. 2007(04)
[10]胚胎显微操作技术进展及存在问题[J]. 谭景和,秦鹏春. 东北农学院学报. 1992(03)
博士论文
[1]小鼠Dlk1-Dio3印记区域内一个新的差异甲基化区的表观遗传学分析[D]. 曾铁波.哈尔滨工业大学 2015
硕士论文
[1]Dlk1-Dio3印记区域内CGI-2调控基因表达的研究[D]. 张栖桐.哈尔滨工业大学 2016
本文编号：3104121
【文章来源】：哈尔滨工业大学黑龙江省 211工程院校 985工程院校
【文章页数】：67 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
小鼠Dlk1-Dio3印记区域结构示意图
图 1-2 CGI-2 差异甲基化区的位置CRISPR/Cas9 是最近发现的一种新型基因组定点编辑技术。CRISPR 是一规则和短隔行重复序列。它是在大肠杆菌编码的碱性磷酸酶基因的研究中[10]。它最初存在于含有多个短重复序列的细菌和古细菌的基因组中。它己提供特定的免疫保护机制。入侵外来的元素，如病毒和质粒[11]。CRISP要依靠 crRNA（CRISPR RNA）和 tracrRNA（反式激活嵌合 RNA）组合Cas 蛋白进行外源 DNA 序列特异性降解[12]。在此基础上，可以在基因组的进行基因打靶，基因插入和基因修复的基因操作。这种新的基因组定点比类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)和锌指核酸酶(ZFN)技术具有构单快捷、突变效率高、成本低廉、适用范围广等许多优点，已成为一种因组编辑工具。该技术已成功应用于细菌、人类细胞、斑马鱼、小鼠、猴以及多种植物的基因组精确修饰，是最具有临床与应用前景的基因治一。所以本课题拟通过利用新一代基因编辑技术 CRISPR/Cas9，建立差区 CGI-2 敲除小鼠并对相关基因印记表达的影响，本研究结果对进一步
图 1-3 CRISPR/Cas9 原理示意图CRISPR/Cas 系统的功能可以分为三个阶段。第一阶段是获得一个新的间隔二阶段是 CRISPR 基因座的表达，包括转录和转录后处理，第三阶段是干扰源基因物质的 CRISPR/Cas 系统。在开始下一段之前，我们首先解释两个名原始间隔序列（原型间隔区），它是一个间隔序列或质粒序列，与间隔序列。PAM 是原型间隔区 5'或 3'末端的保守序列，其长度一般为 2-5bp，接近原区[57]。在不同的菌株或不同类型的 CRISPR/Cas 系统中，PAM 序列和位置的。例如在酿脓链球菌中，PAM 序列是 NGG，N 可以是任何核苷酸，没有差位于原型间隔子的 3'末端[58,59]，而在嗜热链球菌（嗜热链球菌）中，I 型 PA是 AGAAA/ T，其位于 3 '原型间隔的末端[60,61]，II 型的 PAM 序列是 GGNG在原型间隔的 3'末端，在 5'末端。在硫化叶菌中 PAM 序列是 TCC[62]。值得是部分 III 型 CRISPR/Cas 系统的原型间隔器中没有 PAM 序列。.3.2 CRISPR/Cas9 的国内外研究现状
【参考文献】：
期刊论文
[1]CRISPR/Cas9技术研究进展[J]. 李和刚,杨峰,张宝珣,李培培,王建华,包汉勋,苗刚,江科,柳楠. 中国畜牧杂志. 2015(21)
[2]CRISPR/Cas技术研究进展[J]. 常振仪,严维,刘东风,陈竹锋,谢刚,卢嘉威,吴建新,唐晓艳. 农业生物技术学报. 2015(09)
[3]CRISPR/Cas:新一代基因编辑技术[J]. 黄妤,王世春. 生命的化学. 2015(01)
[4]CRISPR/Cas9系统介导基因组编辑的研究进展[J]. 刘志国. 畜牧兽医学报. 2014(10)
[5]外源基因在转基因动物中遗传和表达的稳定性[J]. 孔庆然,刘忠华. 遗传. 2011(05)
[6]DNA甲基化研究进展[J]. 王琦,胡凤成,李春明. 科技情报开发与经济. 2009(29)
[7]转基因技术在动物遗传改良上的应用进展[J]. 刘中华,王华岩,乔宪凤,郑新民. 湖北农业科学. 2009(02)
[8]哺乳动物转基因技术研究概况[J]. 孙剑锋,岳文斌. 山西农业科学. 2008(01)
[9]转基因技术改良家畜的现状与趋势[J]. 童佳,李宁. 中国农业科技导报. 2007(04)
[10]胚胎显微操作技术进展及存在问题[J]. 谭景和,秦鹏春. 东北农学院学报. 1992(03)
博士论文
[1]小鼠Dlk1-Dio3印记区域内一个新的差异甲基化区的表观遗传学分析[D]. 曾铁波.哈尔滨工业大学 2015
硕士论文
[1]Dlk1-Dio3印记区域内CGI-2调控基因表达的研究[D]. 张栖桐.哈尔滨工业大学 2016
本文编号：3104121
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/jiyingongcheng/3104121.html
最近更新
教材专著
